基于纳米界面调控的生物传感新方法构建及应用

论文摘要

纳米材料在生物传感领域引起了极大的关注。独特的物理和化学特性使纳米材料成为设计和构建具有多种功能的高性能电化学生物传感器的理想选择。此外,表面功能可以直接在改性过程中引入。如今,纳米材料形状、尺寸的可控合成使得它在电化学生物传感器中的使用显著增加。到目前为止,电化学传感器是最大的传感器组,由于生物识别可直接转换为电信号的优势而成为一种具有独特吸引力的研究手段。本论文研究工作主要包括以下五个部分:1、基于CoA-Au配位聚合物的新型电化学传感平台用于生物环境中过氧化氢的灵敏检测越来越多研究表明,过氧化氢（H2O2）在多种生理过程的调节中发挥着有效作用,开发H2O2灵敏探针是一个紧迫的需求。在这项工作中,我们利用CoA中的巯基与Au（III）形成巯基-Au（I）结构制备了一种辅酶A（CoA）介导的金配位聚合物（简称CoA-Au（I）CP）,由于CoA中的腺嘌呤结构,CoA-Au（I）CP和石墨烯（GO）可相互结合,用于H2O2的电化学分析检测。这种基于CoA-Au（I）CP的传感器表现出优异的电催化性能,检测限低至0.02μM。所制备的电化学生物传感器也能够用于复杂样品和宫颈癌细胞中的H2O2检测。2、基于原位生长DNA模板化银纳米簇用于末端转移酶活性的无标记电化学检测基于氧化石墨烯（GO）和经末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化产生的富含胞嘧啶（C）的DNA模板化银纳米簇（DNA-AgNCs）的独特电催化活性,建立了一种新的无标记电化学方法。TdT可以催化脱氧胞嘧啶核苷（dCTP）连接到单链DNA（ssDNA）的3’-OH末端;在Ag（I）存在下,TdT产生的富C的DNA序列可作为AgNCs的合成模板。实验证明原位生长的DNA-AgNCs可以吸附在GO电极上,对H2O2具有很高的电还原活性。在最佳条件下,制备的生物传感器可用于TdT活性的定量分析,并且在0.490 U/mL的动态范围内,检测限为0.08U/mL。该方法具有高灵敏度和优异的选择性,为TdT活性检测及其相关抑制剂筛选构建了一种简单、方便、特异的电化学方法。它对TdT的生化研究、疾病诊断和药物发现的实际应用具有很大的潜力。3、基于原位生长的DNA模板化铜纳米簇用于TdT和BamHI活性的无标记电化学检测电化学方法具有快速、简单、价廉的优势。基于末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的信号放大方法建立了一种高效、灵敏、无标记的电化学方法用于DNA相关酶活性的检测。TdT可以将脱氧胸腺嘧啶核苷（dTTP）催化到单链DNA（ssDNA）的3’-OH末端形成富T的DNA链,该链可以用作铜纳米簇（CuNCs）的合成模板。之后,将DNA模板化的CuNCs（DNA-CuNCs）吸附在氧化石墨烯（GO）表面,显示出对H2O2的优异电还原活性。在最优条件下,制备的生物传感器用于定量检测TdT活性,检测限为0.1 U/mL。该传感器展示出较好的选择性和优异的稳定性,并进一步应用于TdT相关的小分子抑制剂筛选。此外,由于BamHI可以使得DNA末端的磷酸基变化为3’-OH末端,所制备的传感器也可以成功应用于BamHI活性检测,在DNA相关酶生物化学研究、疾病诊断和药物发现方面具有良好的前景。4、基于类蛋白质纳米线的电化学生物传感器检测乙酰胆碱酯酶活性及其抑制剂基于合成的L-Cys-Ag（I）配位聚合物（L-Cys-Ag（I）CP）,其形状类似于蛋白质纳米线,构建用于检测乙酰胆碱酯酶（AChE）活性和筛选其抑制剂的高灵敏度电化学生物传感器。这种传感方法涉及氯化乙酰胆碱（ACh）与乙酰胆碱酯酶（AChE）反应形成胆碱,胆碱又被胆碱氧化酶（ChOx）催化氧化产生过氧化氢（H2O2）,L-Cys-Ag（I）CP具有还原H2O2的电催化性能。该系统基于类蛋白质纳米线的传感器能够通过电流-时间（i-t）响应有效地分析连续的H2O2,并且进一步应用于AChE活性的电化学检测。制备的传感器高度灵敏（检测限为0.0006U/L）并且可用于筛选AChE的抑制剂。进一步建立了AChE抑制模型,并采用两种传统的AChE抑制剂（多奈哌齐和他克林）来验证该系统的可行性。多奈哌齐和他克林的IC50分别为1.4 nM和3.5 nM。构建了一种新型的且应用前景广阔的平台,用于检测AChE活性,具有成本低、灵敏度高和选择性好的特点,可用于其抑制剂的筛选。5、基于四面体DNA介导的石墨烯纳米层构建超灵敏p300电化学发光免疫传感器蛋白质p300是一种多功能转录共激活因子,参与许多生理过程,包括细胞周期控制、分化和凋亡,其中它作为连接特定转录因子与基本转录机制的蛋白质桥,作为完成多个转录辅助因子的支架,和催化酶乙酰化组蛋白和非组蛋白。因此,转录调控过程中的整个p300分析显得尤为重要。在此基础上,由四面体DNA（TDN）介导的石墨烯纳米层构建了超灵敏电化学发光（ECL）免疫传感器,该石墨烯纳米层由氧化石墨烯（GO）和Au纳米晶体（AuNCs）组成。通过抗原-抗体相互作用,由丰富的信号分子Ru（phen）32+和TDN的中空结构实现强大且稳定的ECL信号响应。特别值得注意的是,我们的超灵敏p300免疫传感器的开发依赖于:石墨烯纳米层允许更大的承载能力和更宽的外亥姆霍兹面（OHP）。该免疫传感器对于p300检测表现出理想的和优异的性能,范围为0.00580 nM,优异的检测限（0.002 nM）。另外,制备的免疫传感器也可用于研究Hela细胞裂解物和血清中的p300检测。这些实验数据表明该方法对p300相关临床诊断和相应药物的发现存在潜在应用。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 主要符号表
• 引言
• 1 文献综述
•   1.1 生物传感器
•     1.1.1 简介
•     1.1.2 电化学生物传感器
•   1.2 纳米材料及其在电化学生物传感器的应用
•     1.2.1 氧化石墨烯
•     1.2.2 核酸纳米材料
•   1.3 本文研究思路
• 2 基于CoA-Au配位聚合物的新型电化学传感平台用于生物环境中过氧化氢的灵敏检测
•   2.1 引言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 试剂和仪器
•     2.2.2 配位聚合物CoA-Au（I）CP的制备
•     2.2.3 传感器的制备
•     2.2.4 活细胞中H2O2 的检测
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 传感器的检测原理
•     2.3.2 传感器的性能表征
• 2O₂'>    2.3.3 传感器检测H₂O₂
•     2.3.4 体外生物样品分析
•   2.4 本章小结
• 3 基于原位生长DNA模板化银纳米簇用于末端转移酶活性的无标记电化学检测
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 试剂和仪器
•     3.2.2 银纳米簇DNA-AgNCs的制备
•     3.2.3 银纳米簇DNA-AgNCs的表征
•     3.2.4 传感器的制备
• 2O₂'>    3.2.5 传感器检测H₂O₂
•     3.2.6 传感器检测Td T活性
•     3.2.7 传感器检测Td T抑制剂
•     3.2.8 体外生物样品分析
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 传感器的检测原理
•     3.3.2 实验条件优化
• 2O₂'>    3.3.3 传感器检测H₂O₂
•     3.3.4 传感器检测Td T活性
•     3.3.5 传感器的重复性、稳定性和实际应用
•   3.4 本章小结
• 4 基于原位生长的DNA模板化铜纳米簇用于TdT和 BamHI活性的无标记电化学检测
•   4.1 引言
•   4.2 实验部分
•     4.2.1 试剂和仪器
•     4.2.2 铜纳米簇DNA-CuNCs的制备
•     4.2.3 传感器的制备
•     4.2.4 传感器检测Td T活性及其抑制剂
•     4.2.5 传感器检测Bam HI活性
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 传感器的检测原理
•     4.3.2 铜纳米簇DNA-CuNCs的表征
•     4.3.3 传感器的性能表征
• 2O₂'>    4.3.4 传感器检测H₂O₂
•     4.3.5 传感器检测Td T活性及其抑制剂
•     4.3.6 传感器检测Bam HI活性
•   4.4 本章小结
• 5 基于类蛋白质纳米线的电化学生物传感器检测乙酰胆碱酯酶活性及其抑制剂
•   5.1 引言
•   5.2 实验部分
•     5.2.1 试剂和仪器
•     5.2.2 类蛋白质纳米线L-Cys-Ag（I）CP的合成
•     5.2.3 传感器的制备
•     5.2.4 传感器检测H2O2、ACh E活性及其抑制剂
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 传感器的检测原理
• 2O₂'>    5.3.2 传感器检测H₂O₂
•     5.3.3 传感器检测AChE的活性
•     5.3.4 传感器筛选AChE的抑制剂
•   5.4 本章小结
• 6 基于四面体DNA介导的石墨烯纳米层构建超灵敏p300 电化学发光免疫传感器
•   6.1 引言
•   6.2 实验部分
•     6.2.1 试剂和仪器
•     6.2.2 捕获单元（Ab1-GO@Fe3O4）的制备
•     6.2.3 信号单元（Ru&GO@AuNCs@TDN-Ab2）的制备
•     6.2.4 传感器的制备
•     6.2.5 体外生物样品分析
•     6.2.6 电化学参数设定
•   6.3 结果与讨论
•     6.3.1 传感器的检测原理
•     6.3.2 实验条件优化
•     6.3.3 传感器检测p300
•     6.3.4 传感器的特异性、重复性、再现性、稳定性和实际应用
•   6.4 本章小结
• 7 结论与展望
•   7.1 结论
•   7.2 展望
• 参考文献
• 在学研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张青青

导师: 胡宇芳,郭智勇

关键词: 生物传感器,电化学检测,纳米材料,核酸,生物酶

来源: 宁波大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,医药卫生科技

专业: 生物学,化学,生物医学工程

单位: 宁波大学

基金: 国家自然科学基金(21605089),国家重点实验室,开放基金(2016001),宁波市自然科学基金(2017A610228,2018A610217),宁波大学王宽诚幸福基金

分类号: R318;O657.1

DOI: 10.27256/d.cnki.gnbou.2019.001001

总页数: 156

文件大小: 7780K

下载量: 34