大岩桐（Sinningia speciosa）SsPIN1基因的克隆与功能分析

论文摘要

输出载体PIN1（PIN-FORMED1）是生长素在植物体内从生成部位运输到作用部位的主要工具之一,与植物的生长发育尤其是叶原基的起始与排列密切相关。本研究以拟南芥、金鱼草等基因组数据为依据设计特异引物,采用同源克隆结合RACE技术从大岩桐获得SsPIN1基因cDNA全长。在此基础上,利用生物信息学手段进行了基因序列分析;采用实时荧光定量PCR技术进行了SsPIN1基因的组织表达模式分析和SsPIN1基因对不同激素处理后的响应分析;利用激光共聚焦显微镜检测了SsPIN1蛋白的亚细胞定位以及磷酸化位点突变对其极性定位的影响;并通过叶盘转化法将SsPIN1基因导入烟草SR-1获得抗性植物。主要研究结果如下:1.通过同源克隆结合RACE方法获得大岩桐SsPIN1基因cDNA全长序列1770bp。该序列编码的蛋白质包含589个氨基酸,分子量为64772.92道尔顿,等电点为8.074。系统发育分析显示,大岩桐SsPIN1蛋白与金鱼草的AmPIN1a的亲缘关系最近。进一步序列比对结果显示,SsPIN1蛋白由较为保守的羧基端和氨基端以及包含300个左右氨基酸的长亲水环（hydrophilic loop,HL）构成。亚细胞定位预测显示SsPIN1定位于质膜（plasma membrane,PM）。跨膜结构域预测显示,SsPIN1蛋白羧基端有5个跨膜结构域,氨基端有4个跨膜结构域,属于膜运输蛋白家族（IPROO4776）中植物运输载体家族（IRRO14024）。2.利用实时定量PCR对SsPIN1基因进行组织表达模式分析发现,该基因在大岩桐盛花期地上所有组织中均有表达。其中在幼叶叶柄中的表达量最高,花瓣与腋芽次之。利用外源激素NAA处理大岩桐幼苗后,SsPIN1基因的表达水平随处理时长的增加呈先上升再下降趋势;利用BA、GA等外源激素处理后,SsPIN1基因表达水平随处理时长的增加表现为上升趋势。3.利用激光共聚焦显微镜观察SsPIN1蛋白亚细胞定位表明,该蛋白定位在质膜上。进一步构建SsPIN1蛋白T228、T249、T287磷酸化位点的单点突变,双突和三突后,发现该蛋白的亚细胞定位发生了明显改变。突变后的SsPIN1蛋白定位在细胞质的趋势增加。其中,单点突变对SsPIN1的极性定位影响较小,三点突变对SsPIN1的极性定位影响最大。这表明磷酸化位点突变对SsPIN1极性定位的影响具有叠加效应。4.基于in fusion方法构建了pBI111L-SsPIN1过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法将SsPIN1基因导入烟草SR-1并进行Kan抗性筛选。抗性植株表现为生长变缓、根系发生受到抑制等相关表型。PCR检测抗性植株nptII基因均呈阳性。进一步通过实时定量PCR分析发现,SsPIN1基因在烟草抗性植株中的表达水平显著升高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 叶序的概述
•   1.2 植物叶序的研究简史
•   1.3 叶序形成的影响因素
•     1.3.1 叶原基对叶序形成的影响
•     1.3.2 顶端分生组织对叶序形成的影响
•     1.3.3 维管组织对叶序形成的影响
•     1.3.4 植物激素对叶序形成的影响
•   1.4 叶序的调控模型
•     1.4.1 调控模型概述
•     1.4.2 基于机械压力的生物物理模型
•     1.4.3 基于生长素浓度和极性运输的生物化学模型
•     1.4.4 其它调控机制
•   1.5 生长素输出载体蛋白
•     1.5.1 PINs蛋白家族
•     1.5.2 PIN1蛋白
•     1.5.3 PIN1蛋白与叶序调控
•   1.6 研究的目的及意义
• 第二章 大岩桐SsPIN1基因cDNA全长的克隆及生物信息学分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 试验材料
•     2.1.2 试验方法
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 总RNA提取
•     2.2.2 SsPIN1基因全长的克隆
•     2.2.3 SsPIN1生物信息学分析
•   2.3 讨论
• 第三章 大岩桐SsPIN1基因的时空表达分析及对外源激素处理的响应
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 试验材料
•     3.1.2 试验方法
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 引物特异性分析
•     3.2.2 SsPIN1基因的组织的表达分析
•     3.2.3 SsPIN1基因对NAA处理的响应
•     3.2.4 SsPIN1基因对GA处理的响应
•     3.2.5 SsPIN1基因对6-BA处理的响应
•   3.3 讨论
• 第四章 磷酸化位点突变对SsPIN1蛋白极性定位的影响
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 试验材料
•     4.1.2 试验方法
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 磷酸化位点的确定
•     4.2.2 重组载体的构建
•     4.2.3 标记基因重组载体的构建
•     4.2.4 亚细胞定位
•   4.3 讨论
• 第五章 SsPIN1基因过表达载体构建及烟草遗传转化
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 试验材料
•     5.1.2 SsPIN1基因过表达载体的构建
•     5.1.3 叶盘法转化烟草SR-
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 过表达载体的构建
•     5.2.2 遗传转化
•   5.3 讨论
• 第六章 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 毕春晓

导师: 徐全乐

关键词: 叶序,大岩桐,磷酸化位点突变,过表达

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金青年科学基金项目(编号:31401910)

分类号: Q943.2

总页数: 71

文件大小: 4574K

下载量: 40