汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

一、汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达(论文文献综述)

张溪[1](2020)在《胰岛素受体与胰岛素样生长因子1受体结构的研究》文中指出胰岛素对糖尿病患者血糖浓度的控制具有至关重要的作用。研究表明,胰岛素通过与胰岛素受体或胰岛素样生长因子1受体结合,进而激活受体相应信号通路来调节细胞的新陈代谢。虽然这两个受体在20世纪70年代已经被发现,但关于它们与胰岛素结合的分子机制至今仍未阐明。同时,由于这两个受体都属于单次跨膜蛋白,蛋白自身又存在很大的结构柔性,所以很难从传统角度对它们开展结构生物学方面的研究。因而,本文基于单颗粒冷冻电镜技术对胰岛素受体与胰岛素样生长因子1受体结构进行了探究,主要研究内容如下:本研究首先构建并筛选了能够过量表达人源胰岛素受体与胰岛素样生长因子1受体的HEK293T稳定细胞系,进而在体外获得了全长受体蛋白。同时,Western blot实验结果显示纯化获得的两受体蛋白均具有自身磷酸化的生理活性,所以可以作为单颗粒冷冻电镜技术研究的对象。根据电镜下样品的状态,对蛋白缓冲液中的去污剂成分进行了优化,最终选用Amphipol A8-35与LMNG来制备样品并用于电镜数据的收集。通过单颗粒冷冻电镜技术,首先探究了无配体结合状态下的胰岛素受体自身结构,发现其自身构象较为灵活,最终获得了两个相对高分辨率的三维模型(分辨率在15(?)与10(?)之间)。同时,根据分子筛和Western blot实验证明了体外胰岛素受体与胰岛素形成的复合物构象并不单一:共获得了4个不同构象的胰岛素受体与胰岛素复合物电镜结构(分辨率在15(?)与5.9(?)之间)。此外,由于本研究得到的电镜结构中Fn III-2与Fn III-3结构域电子密度更为完整,两个Fn III-3结构域的末端也清晰可见,进而发现结合1个胰岛素分子复合物的结构中两个Fn III-3结构域之间并无直接的相互作用。最终,根据胰岛素受体与胰岛素结合的动态结构模型,α-CT螺旋对胰岛素受体自身构象影响较大,而结合胰岛素分子的数目则影响Fn III-2与Fn III-3结构域的稳定性。同样,在对胰岛素样生长因子1受体相关结构的研究中,利用单颗粒冷冻电镜技术解析了胰岛素样生长因子1受体与胰岛素和胰岛素样生长因子1两复合物的电镜结构,其分辨率分别达到了4.2(?)和7.7(?)。通过三维重构与Western blot实验发现虽然胰岛素样生长因子1受体仅能结合1个配体分子(胰岛素或胰岛素样生长因子1),但其胞内酪氨酸激酶结构域却均被激活。此外,胰岛素样生长因子1受体与胰岛素分子结合的单体Protomer A构象与胰岛素受体相关构象保持一致,而未结合配体分子的单体Protomer B的L1结构域则处于两单体的Fn III-3结构域之间,这与胰岛素受体相关构象不同。综上,人源胰岛素受体与胰岛素样生长因子1受体相关冷冻电镜结构的研究揭示了两受体与配体结合的构象差异及对应的内在分子机制,为进一步开展两受体在胰岛素信号传导过程中生理功能及靶点药物设计的研究提供新思路。

李琴[2](2019)在《粟酒裂殖酵母Ppr10-Mpa1复合体的制备》文中认为线粒体作为一种具有双层膜结构且能独立复制的细胞器,是细胞内合成ATP的主要场所。在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe,S.pombe)中,线粒体基因组(mtDNA)的表达对线粒体功能的发挥至关重要。mtDNA主要编码氧化磷酸化复合物的7个关键亚基,线粒体蛋白合成所需要的两个核糖体亚基和25种tRNA以及RNase P的RNA亚基(rnpB)。PPR蛋白含有2-30个PPR模体,该结构由简并的35个串联重复的氨基酸组成,可与RNA结合。在人和小鼠、植物和芽殖酵母等物种中,PPR蛋白参与了mtDNA编码的基因表达的转录和转录后调控。PPR蛋白与RNA特异结合,与RNA5′端成熟、内含子剪切、RNA编辑和稳定等密切相关。我们实验室报道Ppr10可以免疫共沉淀出Mpa1,以及Ppr10和Mpa1参与了线粒体蛋白质的翻译。但是不清楚Ppr10和Mpa1形成复合体的生理意义。本文针对上述问题开展了研究。首先利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)方法检测Ppr10和Mpa1在活细胞内的相互作用,Western blotting和荧光显微镜观察实验结果表明Ppr10与Mpa1在体内存在直接相互作用。另一方面,体外研究Ppr10和Mpa1相互作用的意义的关键是获得Ppr10-Mpa1复合体和Ppr10。本文利用粟酒裂殖酵母ESP?表达系统表达了Ppr10-Mpa1复合体和Ppr10。为得到Ppr10-Mpa1复合体,利用ESP?表达系统将ppr10和mpa1克隆到pESP2质粒上,实现蛋白Ppr10和Mpa1在粟酒裂殖酵母中共表达。利用FastPrep-24仪器和GST亲和层析柱纯化得到Ppr10-Mpa1复合体,复合体基本达到体外研究对于蛋白纯度的要求。作为对照实验,利用同样的方法在粟酒裂殖酵母中表达Ppr10并纯化GST-Ppr10。本文研究为后续体外研究Ppr10和Mpa1相互作用的生理意义,如利用荧光热稳定性方法检测Mpa1是否促进Ppr10的稳定性打下了基础。粟酒裂殖酵母Atp4被预测为线粒体ATP合酶F0的组成蛋白,但是具体功能并不清楚。本文通过表型研究发现atp4敲除后菌株出现生长缺陷,荧光显微镜观察发现atp4定位于线粒体内。Atp4的缺失导致线粒体基因组编码的蛋白Cob1、Cox1、Cox2和Atp6表达水平急剧下降。以上研究说明atp4对线粒体蛋白表达量的稳定很重要。

张梦雄[3](2016)在《基于单B细胞的汉坦病毒全人源中和单抗的研制》文中研究指明肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒引起的急性传染性疾病,在世界范围内广泛流行,疫源地分布于5大洲70多个国家,已成为世界公共卫生问题。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家,年报告发病人数约为4万-6万,占世界报告病例总数的90%以上。HFRS严重危害人民的生命健康安全,是我国重点防治的急性传染病之一。近些年来合并较多并发症的HFRS病例在临床上越来越多地出现,这些病例极易进展至多器官功能衰竭、颅内出血和弥散性血管内凝血,这些亦是该病导致死亡的主要原因,因此虽然近几年肾综合征出血热的年发病率有所下降,但针对该病的防控形势却越来越严峻。目前市场上还没有肾综合征出血热的特效治疗药物,临床上主要以对症治疗为主。研究表明抗汉坦病毒中和抗体可以快速有效地中和体内的汉坦病毒,达到治疗的目的,所以通过抗汉坦病毒中和抗体治疗肾综合征出血热,已经成为国内外临床医学和生物制药专家的共识。本实验尝试利用基于单细胞PCR技术的全人源单克隆抗体制备技术,进行抗汉坦病毒全人源中和抗体的研制。首先采集了4名肾综合征出血热患者的恢复期外周血共80m L,通过密度梯度沉降法,从这些外周血中分离出淋巴细胞。然后根据B细胞表面分子标记特征对分离的淋巴细胞进行荧光标记,通过流式细胞分选仪分选CD3-/CD20-/CD19+/C D27+/CD38+的单个浆细胞,共分选获得2200个B淋巴细胞。接下来分两步从单个B细胞中扩增抗体基因。由于单B细胞中的抗体基因序列是未知的,而抗体基因又具有丰富的亚型,因此第一步以覆盖绝大部分抗体可变区基因家族的18条引物进行RT-PCR,在一个反应体系中同时扩增单个B细胞中抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因;第二步再以RT-PCR的产物做为模板,分三个反应体系进行巢式PCR,分别扩增H链、κ链以及λ链可变区基因,重链扩增VDJ重链基因区段,轻链扩增VJ轻链基因区段,混合引物包括针对每一个抗体可变区基因家族的特异引物。最终从2200个单个B淋巴细胞中获得了427个H链可变区基因片段、880个κ链可变区基因片段458个λ链可变区基因片段,阳性比例分别为20%、40%和21%,轻链中κ链和λ链的占比分别为66%和34%,基本符合人的表达κ链和λ链的B细胞的比例,其中轻重链基因天然配对且唯一的抗体基因是130对。获取抗体基因后需要进行抗体表达和筛选,但是传统构建表达载体转染哺乳动物细胞表达抗体的方式费时费力,为了加速初期筛选,我们尝试利用线性表达框表达130对抗体基因。构建线性表达框时将CMV启动子、抗体信号肽序列、抗体轻/重链的可变区基因序列、抗体轻/重链恒定区序列和poly A信号序列等转录翻译必需元件通过一步重叠延伸PCR构建成一个完整的线性片段,将轻/重链线性片段共转染HEK-293悬浮细胞,130个抗体中120个获得表达,与传统的克隆方法相比,通过线性表达框表达抗体,大大降低了工作量,在3-4天内便可获得可用于后续筛选的抗体。线性表达框表达抗体的水平多数可以达到1.2μg/m L以上,可以满足抗体特异性筛选的需要。随后以灭活的汉坦病毒作为抗原,通过ELISA对成功表达的抗体进行了特异性检测,结果显示,120个单抗中有51个可以特异性结合灭活的汉坦病毒,占42.5%。随后我们从这51个单抗中挑选30个特异性较高的单抗,将其轻重链构建到表达载体中,并瞬时转染到HEK-293悬浮细胞中进行表达纯化,30个都获得了表达,纯化后抗体浓度在0.5-1.2mg/m L之间。抗体中和活性检测我们采用的是荧光抗体病毒中和试验,通过FITC标记的抗汉坦病毒单抗检测病毒感染的细胞定量病毒,进而判断单抗的中和作用。通过检测我们筛选到2个具有中和活性的抗体(20C8、11H11),两者中和效果都存在剂量依赖关系,其中11H11中和作用明显强于20C8,0.16μg的11H11可以中和70%200 TCID50病毒,而中和同样的病毒需要0.64μg的20C8。以灭活的汉坦病毒作为抗原,采用ELISA方法初步测定抗体与抗原的结合力,20C8的结合EC50约为8.3×10-8 mol/L,11H11的结合EC50约为1.8×10-6 mol/L。汉坦病毒结构蛋白G1和G2蛋白是两个主要的中和抗原,预期以这两个蛋白作为抗原筛选特异性抗体,分别用HEK-293悬浮细胞和毕赤酵母表达这两个蛋白的膜外区,结果在毕赤酵母中G2蛋白有少量表达,而G1没有检测到表达产物;G1和G2在HEK-293悬浮细胞中都可以实现表达,但是G1和G2主要存在于细胞膜上,没有分泌到细胞外。汉坦病毒中和抗原G1/G2的表达一直是世界性难题,后续需要在现有工作基础上开展进一步研究,为确定20C8和11H11的抗原表位,并深入评价这两株抗体的亲和力和特异性奠定基础。利用本课题所建立的单B细胞全人源抗体制备技术,可以从传染病患者或者疫苗免疫者外周血出发制备预防或治疗性抗体,是研制突发传染病病原体中和抗体的有效手段;本研究筛选到的两个具有中和活性的抗汉坦病毒单抗,经过进一步的评价和优化,可能成为潜在的治疗HFRS的被动免疫制剂。

王树云,高志强,张旻,谷强,任彤,刘艳华,江育林,张利峰[4](2016)在《传染性造血器官坏死病病毒参考蛋白的研制》文中认为为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险,本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的糖蛋白来制备参考蛋白,作为IHNV免疫学检测参考物质。本研究选用IHNV糖蛋白基因(IHNV-G)为目的基因,根据Gen Bank中IHNV全基因序列设计特异性引物,以IHNV-uk株病毒核酸为模板,通过RT-PCR获得糖蛋白基因片段,将其克隆至真核表达载体p PICZαA,转入毕赤酵母感受态细胞GS115中,使外源基因与酵母基因融合,通过1%甲醇诱导表达外源蛋白,SDS-PAGE分析显示获得可溶性表达蛋白,分子量大于70 ku。经Western Blot和ELISA分析,该表达产物可以被IHNV多抗特异性识别。0.1531 mg的重组蛋白与0.3125TCID50 IHNV在ELISA实验中反应原性相当,–20°C可稳定保存2个月,说明其在一定程度上可替代病毒作为参考物质。该研究为IHNV ELISA检测试剂盒的开发奠定基础。

李洪波[5](2014)在《黏玉米谷氨酰胺转氨酶微生物异源表达及其酶学性质研究》文中研究说明谷氨酰胺转氨酶(protein-glutamine: amine γ-glutamyltransferase,简称TGase, EC2.3.2.13)是一种催化酰基转移反应的酶,它能催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基(氨基受体)和赖氨酸残基的ε-氨基或其它伯胺基(氨基供体)之间的酰基转移反应。TGase的这种催化作用改变了蛋白质的构象,实现了蛋白质分子内、分子间的交联,从而改善了蛋白质的功能性质。TGase广泛分布于自然界,但植物来源TGase的分离纯化困难、得率较低,限制了研究者对植物来源TGase的研究,将其进行异源表达是解决这一问题的有效途径。本论文分别利用大肠杆菌、毕赤酵母表达系统表达黏玉米来源TGase(TGZ),同时利用重叠区扩增基因拼接法对tgz基因进行密码子优化,从而达到TGZ的高效表达,并将纯化后TGZ与微生物来源TGase(MTG)的功能特性进行了比较研究。为了研究tgz基因中叶绿体转移肽对TGZ可溶性表达和产量的影响,分别将tgz和不含叶绿体转移肽的tgz基因转入大肠杆菌感受态细胞,诱导发现两种表达产物均以包涵体的形式存在,且表达量无明显差异,说明叶绿体转移肽对TGZ的可溶性表达和产量无显着影响。对重组TGZ的表达条件进行优化,结果表明:含有tgz基因的重组ArcticExpress E. coli菌株,于37℃在LB培养基中培养至OD600约为0.4时,加入0.2mmol/L IPTG,于16℃诱导16h后获得TGZ的最大表达。诱导表达后,用8mol/L尿素溶解包涵体,复性后用亲和层析法进行分离纯化,纯化后TGZ活性为0.34U/mg,产量达到1.41mg/L。为了获得TGZ的可溶性表达,将tgz基因在真核表达宿主毕赤酵母中进行诱导表达。首先在不改变TGZ氨基酸序列的基础上,根据毕赤酵母密码子的偏好性,对tgz基因进行密码子优化。由于tgz基因含有15个重复序列,且重复序列个数对TGZ活性无影响,为了正确合成tgz基因,我们只保留一个重复序列,并把tgz分为A、B和C三个亚片段,利用重叠区扩增基因拼接法对优化后tgz基因(tgzo)进行合成。与tgz基因相比,tgzo基因共改变了289个核苷酸,涉及239个氨基酸,G+C含量从53.1%下降至40.3%,与毕赤酵母的G+C含量相符。同时为了便于后续的分离纯化,设计的tgzo基因带有组氨酸标签。将tgz和tgzo基因分别与载体pPIC9K连接,构建重组表达载体pPIC9K-tgz和pPIC9K-tgzo。将两种重组载体单酶切后通过电击转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经表型、G418抗性及菌落PCR法筛选出His+Mut+表型的高拷贝重组菌株G-tgz和G-tgzo。将两种重组菌株分别进行甲醇诱导表达,其中G-tgz通过凝胶过滤层析和离子交换树脂进行分离纯化,纯化后TGZ的比活达到0.32U/mg,产量达到1.44mg/L。G-tgzo则通过亲和层析法进行分离纯化,纯化后TGZo的比活达到0.89U/mg,产量达到4.4mg/L。密码子优化后,TGZo的酶活分别是大肠杆菌表达TGZ的2.6倍,毕赤酵母表达TGZ的2.8倍,产量分别是大肠杆菌和毕赤酵母表达TGZ的3.1倍,所以通过密码子优化设计,成功的提高了TGZ的活性和产量。为了提高重组子G-tgzo的表达量,本实验对诱导培养基、甲醇浓度、诱导时间、装液量、诱导阶段pH、诱导前菌体生物量、油酸及PMT1进行了单因素优化,确定了各因素的最佳值。采用Plackett-Burman设计及响应面分析法确定了最佳的表达条件:重组子G-tgzo用37mL pH6.5的改良BMMY培养基(含有0.006%PMT1和0.07%油酸)重悬至OD600为2时,于28℃诱导96h,每24h时补加100%甲醇,使其终浓度为1.31%,同时补加0.006%PMT1和0.07%油酸。在该条件下TGZo的活性达到1078mU/mL,比优化前提高了1.8倍。利用亲和层析法分离纯化TGZo,产量达到7.6mg/L,是优化前的1.73倍。采用荧光测定法对不同来源TGase的酶学性质进行研究。结果表明,重组酶对酪蛋白的亲和力低于MTG,TGZo的最适反应温度为37℃,低于TGZe和MTG的45℃,但是重组酶的温度稳定范围高于MTG,为460℃。重组酶的最适反应pH为8.0,高于MTG的7.0,且在偏碱性条件下重组酶的稳定性更好。不同金属离子对酶活性有一定的影响,其中低浓度的Ca2+对重组酶的促进作用最强。两种酶对不同底物蛋白的交联作用研究表明,TGZo和MTG对酪蛋白和大豆分离蛋白有显着的交联作用,其中TGZo对大豆分离蛋白的交联作用高于MTG,但是TGZo对乳清蛋白无交联作用。将重组TGZo用于酸奶发酵,发现它能提高酸奶的质构参数、表观黏度,降低酸奶的乳清析出量,但是TGZo的酶学性质导致了其对酸奶品质的改善作用低于MTG。同时研究了TGZo对不同脂肪含量酸奶样品的改善作用,发现脂肪对酶的催化作用影响不大。这些结果为植物来源TGase在食品工业中的应用奠定了基础。

程林峰[6](2014)在《汉滩病毒嵌合病毒样颗粒的制备及其免疫学特性研究》文中研究表明【背景】汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)在我国主要引起肾综合征出血热(Hemorrhagicfever with renal syndrome,HFRS),该病危害极为严重,目前尚缺乏特效的治疗药物,主要使用疫苗进行预防。目前我国已成功研制HFRS灭活疫苗,其推广使用对预防HFRS的发生和流行起到了积极作用。但该类疫苗仍存在一些问题,主要是不能有效刺激细胞免疫应答,诱导机体产生中和抗体的能力也较弱,抗体滴度不高等,因而研发新型的HFRS疫苗成为当务之急。近年来,病毒样颗粒(Virus-like Particle,VLP)疫苗由于其安全性好和免疫原性强的优点使得其成为目前最有发展前景的新型基因工程候选疫苗之一。同时研究发现通过对VLP进行修饰,将细胞因子锚定到VLP表面使其成为嵌合VLP可以使其具有更好的免疫原性。本研究通过杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)分别表达HTNV包膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)来构建HTNV VLP,同时表达糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)或CD40配体(CD40Ligand,CD40L),使之修饰在VLP表面,获得了两种HTNV嵌合VLP(VLP-GM-CSF,VLP-CD40L),并对其生物学活性和免疫学特性进行了研究,以期为进一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定理论和实验基础。【方法】将HTNV76-118株编码GP的M基因和编码NP的S基因以及小鼠的GPI-GM-CSF(以下简称GM-CSF)、CD40L基因分别克隆入BEVS中的pFastBacTMDual转移载体中,构建各重组杆状病毒(recombinant Baculovirus,rBV)转移载体(pFastBacTMDual-M、pFastBacTMDual-S、pFastBacTMDual-GM-CSF、pFastBacTMDual-CD40L),酶切后琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,并进行序列测定。将构建好的各rBV转移载体分别转化大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)DH10BacTM后提取各rBV杆粒,即Bacmid-M、Bacmid-S、Bacmid-GM-CSF、Bacmid-CD40L,并利用PCR进行鉴定。将构建好的各rBV杆粒转染sf9昆虫细胞后获得各rBV,分别命名为rBV-M、rBV-S、rBV-GM-CSF、rBV-CD40L。取各rBV感染sf9昆虫细胞,利用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测各目的蛋白的表达。将rBV-M、rBV-S以及rBV-GM-CSF或rBV-CD40L通过共感染sf9昆虫细胞的方式分别制备各组VLP(VLP、VLP-GM-CSF、VLP-CD40L),在电镜下观察sf9昆虫细胞内及培养上清中的各组VLP的组装情况。分别大量制备和收集各组VLP,通过蔗糖密度梯度离心法纯化各组VLP,并利用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunoadsordent assay,ELISA)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(Sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Westernblot,WB)、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)等方法进行鉴定。在上述工作的基础上,研究分析了各组VLP的生物学活性及免疫学特性。通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分别检测了各组VLP促小鼠骨髓细胞增殖能力、促小鼠骨髓细胞向树突状细胞(Dendritic cells,DC)分化能力以及促B淋巴细胞活化能力。将各组VLP通过皮下注射途径免疫C57BL/6小鼠,以添加外源重组细胞因子的VLP(VLP+GM-CSF、VLP+CD40L)、HFRS灭活疫苗以及PBS为对照。通过ELISA及微量细胞中和试验分别检测免疫后各组小鼠血清中抗HTNV GP及NP的特异性抗体及中和抗体的滴度,以反映各组小鼠的体液免疫应答的情况;通过酶联免疫斑点试验(Enzyme Linked Immunospot assay,ELISPOT)及细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤试验分别检测免疫后各组小鼠脾细胞分泌细胞因子的水平以及其CTL杀伤活性,以反映各组小鼠的细胞免疫应答的情况;取HTNV76-118株通过肌肉注射途径接种各组免疫小鼠,通过ELISA及实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分别检测接种后各组免疫小鼠脏器组织中HTNV抗原及核酸,通过苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色各组小鼠脏器组织并进行镜检,观察接种后各组免疫小鼠脏器组织的病理学变化,以评价各组VLP预防接种对HTNV感染的保护作用。【结果】将各目的片段克隆入BEVS转移载体后,酶切鉴定结果显示,各rBV转移载体均切出与相应目的基因大小相一致的核酸条带;测序结果显示,各目的基因序列正确,无突变产生,表明成功地构建了各rBV转移载体。对重组杆粒PCR鉴定结果显示,各rBV杆粒中均扩增出与预期大小相一致的核酸条带,证实各组rBV杆粒构建正确。将各重组杆粒转染昆虫细胞获得rBV,感染细胞后IFA检测结果显示,各组rBV均可表达相应的目的蛋白。将各rBV共感染昆虫细胞后,电镜观察结果显示,在昆虫细胞内及培养上清中均可清楚地观察到直径大小约为80220nm的颗粒,初步判定为各组VLP。大量制备各组VLP,利用蔗糖密度梯度离心进行纯化,离心结束后能够清晰的观察到各组VLP的聚集带。SDS-PAGE及WB检测各组VLP,结果发现各组VLP中均含有与相应目的蛋白大小相一致的特异性蛋白条带。ELISA及Co-IP检测结果显示,在嵌合VLP中,GM-CSF或CD40L均成功地锚定在VLP上。对各VLP进行生物学活性检测的结果显示,各组VLP均可刺激小鼠骨髓细胞的增殖和向DC的分化,并有效地促进了小鼠B淋巴细胞的活化,且VLP-GM-CSF的刺激能力要强于VLP-CD40L和VLP(p<0.05)。对各VLP免疫小鼠进行免疫学活性检测的结果表明,各组VLP均可刺激C57BL/6小鼠产生针对HTNV GP、NP的特异性抗体以及中和抗体,且VLP-CD40L和VLP-GM-CSF组抗体滴度均高于VLP组、灭活疫苗组,以及相应的外源细胞因子添加组VLP+CD40L、VLP+GM-CSF,其中VLP-CD40L组抗体滴度最高(p<0.05)。在HTNV GP或NP刺激下,与PBS组相比,各组VLP均可增强小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-2的水平,且VLP-CD40L、VLP-GM-CSF组小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-2水平均高于VLP组、灭活疫苗组,以及相应的外源细胞因子添加组,其中VLP-CD40L组分泌水平最高(p<0.05),而各免疫组小鼠脾细胞分泌IL-4和IL-10的水平无明显差异(p>0.05)。在HTNV GP或NP刺激下,与PBS组相比,各组VLP均可增强小鼠脾细胞的杀伤活性,且随着效靶比(Effector cell/Target cell,E/T)的升高而增强。VLP-CD40L、VLP-GM-CSF组小鼠脾细胞杀伤活性在不同E/T时均高于VLP组、灭活疫苗组,以及相应的外源细胞因子添加组,其中VLP-CD40L组杀伤活性最高(p<0.05)。免疫小鼠保护实验的结果显示,PBS对照组小鼠的肝脏、脾脏和肾脏组织中的HTNV抗原检测均为阳性,而其他各实验组以及正常对照组小鼠的所有脏器组织均未检测到HTNV抗原。RT-PCR检测各组小鼠脏器中HTNV核酸的结果与病毒抗原结果结果相一致。HE染色镜检结果显示,PBS组小鼠的脾脏中出现了弥漫性出血,淋巴细胞弥漫性浸润以及白髓增多等病理学变化,而其他各实验组以及正常对照组小鼠的所有脏器组织均未观察到病理学变化。上述结果提示,HTNV能够感染未经免疫的C57BL/6小鼠,而经各VLP免疫后能够保护小鼠免受HTNV的攻击。【结论】本研究通过BEVS表达系统获得了嵌合有GM-CSF或CD40L的HTNV VLP,各嵌合VLP均具有有良好的生物学活性,同时嵌合在VLP表面的CD40L或GM-CSF有效地增强了其刺激机体产生特异性免疫应答的能力,且各项指标均优于HFRS灭活疫苗组。免疫小鼠保护实验结果证实嵌合VLP可以有效地保护C57BL/6小鼠免受HTNV的攻击。本研究为进一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定了良好的理论、实验和物质基础。

王曼[7](2014)在《人类肠道病毒71型与EB病毒疫苗候选抗原在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究》文中研究表明甲基营养型毕赤酵母是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统之一,该表达系统具有产量高,操作简单,表达稳定及成本低等优点。毕赤酵母还具有蛋白翻译后修饰加工系统,非常适合作为真核生物蛋白的大规模生产平台。本论文主要采用毕赤酵母系统表达人肠道病毒EV71和EB病毒(Epstein-Barr virus)疫苗候选抗原,并进一步研究候选抗原的免疫原性。EV71是手足口病的主要致病原之一,能引起儿童患者严重神经系统疾病甚至死亡。由于EV71感染性强且致病率高,EV71病毒已导致手足口病疫情多次爆发。然而目前仍缺乏有效的抗病毒药物与预防疫苗。研究表明EV71衣壳蛋白VP1具有较强的免疫原性:重组VP1能够有效诱导中和抗体产生,并保护新生小鼠免于病毒致死性感染。因此VP1蛋白是具有潜力的EV71疫苗候选抗原。EBV是常见的感染人类B细胞的γ疱疹病毒,能在95%以上人群中进行慢性潜伏感染。EBV是感染性单核细胞增多症的致病原,能够诱发淋巴及上皮肿瘤。EBV的致癌性使得EBV疫苗的研制工作尤为紧迫与必要。目前EBV治疗型疫苗研究主要集中于EBV核抗原1(EBNA1)上,而预防型疫苗则主要以EBV包膜蛋白gp350为研究重点。EBNA1是在所有EBV相关恶性肿瘤中唯一表达的病毒蛋白,并在EBV潜伏感染过程中具有重要作用。研究表明EBNA1特异T细胞能够有效杀伤EBV阳性肿瘤细胞,因此EBNA1被认为是EBV相关恶性肿瘤免疫治疗的候选抗原。gp350在病毒感染过程中具有重要作用,gp350与B淋巴细胞表面2型补体受体(CR2)结合介导病毒进入和感染靶细胞。大量研究表明gp350是中和抗体的首要靶标,为EBV预防型疫苗的首要候选抗原。本论文在毕赤酵母中成功表达了VP1, EBNA1和gp350,并取得了创新性成果,研究结果主要分为以下三个部分:1.将密码子优化EV71衣壳蛋白VP1序列插入到真核表达载体中,然后将重组表达载体转化至毕赤酵母中进行诱导表达;成功获得分泌表达的重组VP1蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析法,从培养上清中分离得到纯化VP1蛋白。以小鼠为研究对象,检测重组VP1蛋白的免疫原性及抗病毒效果。实验结果显示重组VP1能够诱导小鼠产生高水平VP1特异抗体,体外中和实验证明这些抗体具有中和EV71病毒活性。新生小鼠被动保护实验进一步证实VP1疫苗的预防保护效果。此外,VP1还能刺激淋巴细胞增殖与Th1型免疫应答反应。综上所述,毕赤酵母表达的VP1蛋白具有较好的免疫原性,能够有效诱导抗病毒抗体产生并激活免疫系统,因此重组VP1具有开发为EV71亚单位疫苗的潜力。2.通过生物信息学分析发现EBNA1抗原表位主要位于蛋白C端结构域,因此选定EBNA1截短体(ElΔGA,390-641位氨基酸)作为EBV治疗型疫苗候选抗原。通过对ElΔGA序列密码子进行优化,构建真核表达载体,并将重组载体转化至毕赤酵母中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western杂交结果显示在毕赤酵母系统中成功表达重组ElΔGA,采用Ni-NTA亲和层析法从酵母培养上清中高效纯化ElΔGA蛋白。将纯化的ElΔGA蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠以获得多克隆抗体,Western杂交结果显示小鼠多克隆抗体能够特异识别B95-8细胞裂解液中EBNA1蛋白。重组ElΔGA能够刺激T淋巴细胞增殖和Thl型免疫应答反应,同时诱导免疫小鼠脾脏和外周血中CD4+T和CD8+T细胞显着增多。这些实验结果表明毕赤酵母表达的ElΔGA具有较强免疫原性,具有开发为EBV相关恶性肿瘤候选疫苗的潜力。3.抗原表位分析发现,gp350蛋白N端结构域含有关键中和表位,具有开发为EBV候选疫苗的潜力。在毕赤酵母系统中成功表达密码子优化的gp350蛋白N端1-443位氨基酸肽段,重组蛋白可通过一步亲和层析法得到有效纯化。本研究为重组gp350蛋白大规模生产及其抗病毒活性深入研究奠定基础。在本论文中,使用毕赤酵母系统成功表达EV71和EBV疫苗候选抗原,研究结果显示重组VP1和ElΔGA能够诱导特异抗体产生,活化免疫系统,并能够刺激细胞因子分泌及淋巴细胞增殖。这些结果表明酵母表达的候选抗原具有较强的免疫原性,并具有开发为抗病毒疫苗的潜力。

林小琼[8](2013)在《基于iTRAQ技术的高效表达木聚糖酶重组毕赤酵母细胞的蛋白组学研究》文中提出毕赤酵母表达系统是通用的、高效的外源蛋白表达系统,广泛地应用于生产和表达各种外源蛋白、研究蛋白的表达和分泌机制。随着基因测序技术的发展,转录组学研究成为基因表达调控的主要方法。然而,基因的转录水平和蛋白表达水平并不是完全一致,从基因到蛋白需要进行转录、翻译和翻译后修饰。蛋白质组学能对不同性能的蛋白质进行系统性研究,并可以比较不同蛋白表达条件下各种蛋白的结构、功能及生物调控系统的变化。因此,蛋白质组学成为蛋白表达调控机制研究的重要手段。质谱技术的快速发展及毕赤酵母基因组测序的完成,为毕赤酵母的蛋白质组研究提供了理论基础。本研究利用iTRAQ技术对重组毕赤酵母细胞的蛋白组进行研究,从中探讨外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达的调控机理。基因剂量是影响外源蛋白表达的重要限制因素之一,通过增加基因拷贝数可以有效提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达。首先,对来源于Bacillus halodurans C125第10家族的木聚糖酶xyn10基因进行毕赤酵母密码子的优化。其次,通过串联表达盒和核糖体rDNA非转录基因间隔区NTS整合的方法构建得到多拷贝菌株,两种方法筛选的菌株中表达木聚糖酶最高的是携带有四拷贝的菌株。四拷贝菌株G4比单拷贝菌株G1产木聚糖酶提高了2.84倍。研究发现,在毕赤酵母中分泌表达外源蛋白时,在一定的拷贝数范围内,蛋白分泌会达到一个极限值,进一步增加基因的转录和翻译水平,外源蛋白的表达量不再增加或者反而降低。在G4菌株中过量表达剪切后的HAC1基因,能进一步增强xyn10木聚糖酶的分泌表达,所得到的G4-H菌株比G4菌株xyn10表达量提高了1.43倍。因此,通过调整基因拷贝数获得最优表达宿主的同时,过量表达辅助蛋白分泌的相关因子对增加蛋白的分泌也极其重要。筛选得到的高表达菌株G4-H菌株,在2L发酵罐进行高密度发酵,在甲醇诱导132h后,木聚糖酶的酶活可达到3361U/mL,胞外总蛋白可达到5.2g/L。通过iTRAQ蛋白质组对三个甲醇诱导产酶菌株(G1、G4、G4-H)进行分析,其中G0菌株作为对照菌株。iTRAQ得到的质谱数据与毕赤酵母基因组、蛋白组匹配情况进行统计分析,鉴定得到的特有肽段序列数为4613个,总共鉴定得到1167个蛋白质。在低表达、高表达和过量表达HAC1的状态下,鉴定得到了352个差异蛋白。对差异蛋白的GO分析和KEGG代谢途径分析发现,在低表达菌株G1中,上调的蛋白主要是能量和物质代谢,以及氨基酸代谢,这些途径为外源蛋白的表达提供必要的能量和物质供给。在高表达的菌株G4中,大量外源蛋白的表达对细胞造成了一定的压力,表现在内质网蛋白折叠和加工相关蛋白上调,氨基酸代谢和甲醇代谢相关蛋白下调。过量表达剪切后的HAC1菌株G4-H中,激活UPR机制。一方面,通过上调参与内质网蛋白折叠的分子伴侣和折叠酶,提高内质网的蛋白折叠能力,同时增加分泌途径相关的蛋白,增强蛋白的分泌。另一方面,核糖体蛋白合成相关蛋白表达下调减少上游蛋白的翻译合成速率,从而减少了进入内质网中的未折叠蛋白,因此缓解了内质网中的蛋白压力。同时物质代谢和能量代谢、氨基酸代谢途径蛋白上调。然而,过量表达HAC1基因会对菌株的生长造成一定的抑制,蛋白质组数据分析发现主要是由于参与核糖体蛋白表达的蛋白表达降低而造成的。

吴敏[9](2013)在《人血清白蛋白融合技术平台的共性与个性问题研究》文中研究说明1、长效HSA/GH融合蛋白的优化设计目前临床使用的部分蛋白/多肽类药物由于分子量较小,在人体内的半衰期短,须频繁注射以维持药效,从而限制了其临床应用,如本文研究的人生长激素(human growth hormone, hGH)、人甲状旁腺激素PTH (1-34)(human parathyroid hormone1-34)。人血清白蛋白(HSA)融合技术是延长蛋白/多肽类药物半衰期的一种简便、灵活的技术,也是目前国内外生物制药研究的热点。在利用HSA融合目的蛋白实现长效的技术研究中,仍有一些基础问题需要解决。如目前所有报道的HSA融合蛋白的体外生物学活性均有不同程度的降低,说明了HSA对所融合的蛋白/多肽的活性位点的干扰。另外,有报道指出,HSA也有可能会影响所融合蛋白的正确折叠或者糖基化位点的暴露程度,导致重组表达的融合蛋白产物不均一。因此,在HSA融合蛋白的开发中有必要考察不同融合方向,连接肽的有无和长短对融合蛋白活性、稳定性的影响,综合考虑各种因素,从而选择一种最优选的融合方式。本文着重研究了连接肽的引入和长短对HSA/GH融合蛋白的体外生物学活性和稳定性影响,为HSA/GH融合蛋白的开发提供了一种优选设计,同时也为其他HSA融合蛋白的设计提供了参考。2、 HSA/GH融合蛋白免疫检测方法的建立目前市场上只有检测GH或者HSA的ELISA试剂盒,没有专门针对HSA/GH融合蛋白的ELISA试剂盒。而在药代动力学研究中,要检测到完整的HSA/GH分子才能准确反映HSA/GH在体内的代谢动力学过程。本文建立了一种能够检测HSA/GH融合蛋白完整分子的双抗夹心ELISA,其检测范围在2.156~69ng/ml,初步应用于大鼠体内的药代动力学研究,为HSA/GH融合蛋白进一步的临床前开发奠定了基础。3、HSA融合蛋白的高效毕赤酵母表达系统的建立酵母表达系统兼具了原核表达系统表达周期短、表达量较高、易于工业化高密度培养的优点以及真核表达系统对外源蛋白进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰的特点,被公认为是一种表达大规模蛋白的强有力工具。研究也表明,酵母表达系统是目前用于HSA重组表达最高效、最经济的一种表达系统,利用毕赤酵母表达一系列HSA融合蛋白具有潜在优势,因此本课题组将毕赤酵母作为首选表达系统,应用于一系列HSA融合蛋白的研究。但在表达一系列HSA融合蛋白时发现,未经优化的毕赤酵母表达系统主要存在两大缺陷,影响了HSA融合蛋白的高效重组表达,严重制约了HSA融合蛋白的临床前研究进程:1)分泌表达过程中的降解问题;2)分泌表达效率普遍较低,使得发酵表达量的提升也非常有限。因此有必要对毕赤酵母表达系统进行优化,实现HSA融合蛋白的高效表达。3.1构建蛋白酶缺陷型宿主改善HSA融合蛋白的降解一系列HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达时都存在不同程度的降解,若与HSA进行融合的蛋白/多肽对蛋白酶敏感,重组表达时的降解问题会更严重,更复杂。由于降解条带一般与完整的HSA融合蛋白性质相近,影响了后续重组蛋白的纯化制备。本文以其中一个典型的易降解蛋白——人血清白蛋白-人甲状旁腺激素(1-34)融合蛋白[HSA/PTH (1-34)]为研究对象,首先通过Western Blot、N端氨基酸测序以及质谱分析证明了表达产物中完整蛋白的存在,并对降解产物进行了表征。文献报道指出,PTH易被酵母中的一类yapsin蛋白酶降解,并且液泡蛋白酶也是导致外源蛋白在毕赤酵母中重组表达时发生降解的主要原因。毕赤酵母中的液泡蛋白酶已经研究的比较清晰,并且已经有敲除主要液泡蛋白酶的商品化蛋白酶缺陷型宿主(SMD1168宿主为proteinase A缺陷型,SMD1163为proteinase A和proteinase B双重缺陷型)。根据毕赤酵母基因组测序结果,毕赤酵母中的yapsin家族共存在7个成员(YPS1, YPS2, YPS3, YPS7, MKC7, YPS’, YPS"),但针对这7个yapsin成员的研究目前相对较少。本文利用同源重组的方法,构建了7个单一YPS敲除的毕赤酵母宿主。通过分析7种单一YPS缺陷宿主和proteinase A, proteinase B缺陷宿主对HSA/PTH (1-34)融合蛋白降解的影响,发现YPS1敲除和proteinase A敲除都有助于改善HSA/PTH (1-34)融合蛋白的降解。通过将YPS1和proteinase A同时敲除,降解得到最大程度的改善,与野生型GS115相比,完整蛋白的产率从30%提高到了80%。3.2多拷贝HSA融合基因整合与分子伴侣共表达相结合,提高HSA融合蛋白的表达量在本课题的前期研究中,以pPIC9为表达载体,在野生型或者蛋白酶缺陷型毕赤酵母宿主中实现了多种HSA融合蛋白的分泌表达,包括:HSA/GH. HSA/PTH (1-34)、 HSA/IL1Ra、 HSA/Thymosin al等等。但同时也发现,这些表达菌株的表达水平普遍较低(25-50mg/L),通过发酵条件优化对表达量的提升也较为有限。这一方面极大的限制了后期纯化蛋白的制备量与制备速度,制约了HSA融合蛋白的临床前研究进程;另一方面也增加了HSA融合蛋白前期开发投入以及后续产业化生产的成本。因此,构建HSA融合蛋白的高表达工程菌株显得尤为重要。本文考察了HSA融合基因拷贝数以及几种重要的分子伴侣共表达对HSA融合蛋白表达量的影响。结果表明,通过两种方式的结合可以使HSA融合蛋白在野生型毕赤酵母中的表达量大幅度提高,如HSA-G,-GH经过优化后的表达量在摇瓶水平从低于50mg/L提高到了364mg/L。该方法也可用于蛋白酶缺陷型宿主,如优化后的HSA/PTH (1-34)在GS115pep4△ypsl△中的表达量也有了显着提高,为一系列HSA融合蛋白的高表达工程菌株的构建奠定了基础。

呼延霆,薛小平,宋凯,汪桦[10](2009)在《汉坦病毒包膜糖蛋白重组表达研究进展》文中认为汉坦病毒(Hantaan virus,HTNV)属于布尼亚病毒科,主要引起人类肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)。Lee等[1]1978年首次在田鼠的肺组织中分离出HTNV,并鉴定其为引起HFRS的病原。HFRS是一种以发烧、出血和肾功能损害为特征的全球性急性病毒传染病,病死率介于40%~

二、汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达(论文提纲范文)

(1)胰岛素受体与胰岛素样生长因子1受体结构的研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 课题背景及研究的目的和意义
        1.1.1 课题研究背景
        1.1.2 研究的目的及意义
    1.2 胰岛素受体结构与功能研究进展
        1.2.1 国外研究现状
        1.2.2 国内研究现状
        1.2.3 总结与分析
    1.3 胰岛素样生长因子1 受体研究进展
        1.3.1 生理功能研究现状
        1.3.2 受体蛋白表达与纯化
        1.3.3 受体结构研究现状
    1.4 膜蛋白样品制备
        1.4.1 膜蛋白表达系统
        1.4.2 膜蛋白的提取
        1.4.3 蛋白标签
        1.4.4 去污剂
        1.4.5 纳米磷脂盘
    1.5 冷冻电镜在结构生物学中的应用
        1.5.1 负染色技术
        1.5.2 单颗粒冷冻电镜技术
        1.5.3 冷冻电镜使用流程
    1.6 本文主要研究内容及技术路线
        1.6.1 主要研究内容
        1.6.2 技术路线
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验药品与试剂
    2.2 实验仪器
    2.3 蛋白纯化缓冲液
    2.4 实验方法
        2.4.1 分子克隆
        2.4.2 细胞复苏、培养与保种
        2.4.3 细胞转染
        2.4.4 稳定细胞系
        2.4.5 Western blot实验
        2.4.6 胰岛素受体的纯化方法
        2.4.7 胰岛素样生长因子1 受体的纯化方法
        2.4.8 蛋白银染
        2.4.9 冷冻电镜
第3章 蛋白纯化及冷冻制样条件的研究
    3.1 引言
    3.2 猪源胰岛素受体蛋白的纯化
        3.2.1 从动物组织中提取胰岛素受体蛋白
        3.2.2 利用抗体Fab片段“钓取”受体蛋白
    3.3 人源胰岛素受体重组蛋白的纯化
    3.4 胰岛素受体冷冻制样与优化
    3.5 胰岛素样生长因子1 受体冷冻制样与分析
    3.6 本章小结
第4章 胰岛素受体结构的研究
    4.1 引言
    4.2 无配体状态下的胰岛素受体结构
    4.3 胰岛素受体与胰岛素复合物的结构
    4.4 胰岛素受体相关原子结构模型构建
        4.4.1 胰岛素受体自身原子结构模型
        4.4.2 IR/insulin复合物原子结构模型
    4.5 分析与讨论
        4.5.1 IR/insulin复合物结构特征
        4.5.2 IR结合胰岛素分子的数目
    4.6 本章小结
第5章 胰岛素样生长因子1 受体结构的研究
    5.1 引言
    5.2 IGF-1R蛋白的纯化及其三维结构
        5.2.1 IGF-1R蛋白的纯化
        5.2.2 数据收集及三维重构
    5.3 分析与讨论
        5.3.1 IGF-1R/IGF-1与IGF-1R/insulin复合物结构的比较
        5.3.2 IGF-1R与配体复合物结构的特征
        5.3.3 IGF-1R与配体复合物结构的分析
    5.4 本章小结
第6章 受体与胰岛素结合机制的研究
    6.1 引言
    6.2 1R与胰岛素复合物电镜结构分析
        6.2.1 IR各结构域电镜结构分析
        6.2.2 IR与胰岛素结合的动态模型
    6.3 IGF-1R与胰岛素复合物电镜结构分析
        6.3.1 IGF-1R/insulin复合物各结构域电镜结构分析
        6.3.2 IGF-1R与配体分子结合的动态模型
    6.4 本章小结
结论
参考文献
攻读博士学位期间发表的论文及其它成果
致谢
个人简历

(2)粟酒裂殖酵母Ppr10-Mpa1复合体的制备(论文提纲范文)

摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 线粒体简介
        1.1.1 结构与功能
        1.1.2 线粒体的基因组
    1.2 PPR蛋白
    1.3 模式生物——粟酒裂殖酵母
    1.4 蛋白质与蛋白质相互作用
    1.5 蛋白质稳定性研究
    1.6 研究内容和方法
第二章 双分子荧光互补法检测Ppr10和Mpa1 的体内相互作用
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种
        2.1.2 所用试剂及耗材
        2.1.3 质粒
        2.1.4 引物序列
        2.1.5 培养基与试剂配制
        2.1.6 仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 质粒的构建
        2.2.2 制备大肠杆菌的感受态细胞
        2.2.3 转化
        2.2.4 醋酸锂转化
        2.2.5 荧光显微镜观察
        2.2.6 碱裂解法提取细胞总蛋白
        2.2.7 Western blotting检测蛋白表达情况
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 双分子荧光实验质粒的构建
        2.3.2 Western blotting检测不同菌株内蛋白Ppr10和Mpa1 表达情况
        2.3.3 荧光显微镜检测BiFC质粒的功能
    2.4 讨论
第三章 Ppr10和Mpa1 在裂殖酵母ESP?表达系统内表达与纯化
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 质粒
        3.1.3 引物序列
        3.1.4 试剂和仪器
        3.1.5 培养基与试剂配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 质粒的构建
        3.2.2 诱导蛋白表达
        3.2.3 Fastprep-24 提取细胞蛋白
        3.2.4 GST亲和层析柱纯化蛋白
        3.2.5 GST pull-down
        3.2.6 碱裂解法提取蛋白
        3.2.7 考马斯亮蓝染色
    3.3 实验结果
        3.3.1 预测Ppr10和Mpa1 线粒体定位序列
        3.3.2 粟酒裂殖酵母ESP?表达系统表达质粒的构建
        3.3.3 平板划线初步检测Ppr10和Mpa1 蛋白表达情况
        3.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳检测Ppr10和Mpa1 分别表达情况
        3.3.5 Fastprep-24 破碎次数对蛋白提取效果的影响
        3.3.6 GST亲和层析柱纯化蛋白GST-Ppr10
        3.3.7 GST pull-down检测体外相互作用
    3.4 讨论
第四章 Ppr10-Mpa1 复合体纯化
    4.1 实验材料
        4.1.1 所用菌株
        4.1.2 所用试剂及耗材
        4.1.3 试剂配制
        4.1.4 引物序列
    4.2 实验方法
        4.2.1 共表达质粒构建技术路线
        4.2.2 碱裂解法提取蛋白
        4.2.3 GST标签纯化蛋白
        4.2.4 GST pull-down
    4.3 实验结果
        4.3.1 共表达质粒的构建
        4.3.2 Ppr10和Mpa1 共表达
        4.3.3 Ppr10与Mpa1 体外复合体的检测
    4.4 讨论
第五章 粟酒裂殖酵母蛋白Atp4 定位和功能的研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 所用菌株和质粒
        5.1.2 所用试剂和仪器
        5.1.3 培养基与试剂配制
    5.2 实验方法
        5.2.1 Atp4 定位预测分析
        5.2.2 Δatp4 菌株构建
        5.2.3 Δatp4 菌株生长表型研究
        5.2.4 酵母线粒体提取
        5.2.5 Western blotting检测Δatp4 和野生型菌株中线粒体蛋白表达量
    5.3 实验结果
        5.3.1 Δatp4 菌株的表型研究
        5.3.2 荧光显微镜观察Atp4 的定位
        5.3.3 Δatp4 菌株中线粒体蛋白表达量降低
    5.4 讨论
全文总结与讨论
参考文献
附录一 菌株
附录二 质粒
在读期间发表的学术论文
致谢

(3)基于单B细胞的汉坦病毒全人源中和单抗的研制(论文提纲范文)

英文缩略词表 中文摘要 英文摘要 前言 第一部分
    肾综合征出血热恢复期患者外周血单B细胞分选及其抗体轻重链可变区基因扩增 1.材料和方法 2.结果 第二部分
    线性表达框高通量表达人单克隆抗体及特异性抗体的筛选 1.材料和方法 2.结果 第三部分
    汉坦病毒全人源中和单克隆抗体的筛选 1.材料和方法 2.结果 第四部分
    汉坦病毒G1、G2蛋白在酵母和哺乳动物细胞中的表达 1.材料和方法 2.结果 讨论 结论 参考文献 个人简历 致谢

(5)黏玉米谷氨酰胺转氨酶微生物异源表达及其酶学性质研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 课题背景及研究的目的和意义
    1.2 不同来源TGase
        1.2.1 动物来源TGase
        1.2.2 微生物来源TGase
        1.2.3 植物来源TGase
    1.3 TGase的应用
        1.3.1 TGase在食品工业中的应用
        1.3.2 TGase在生物医学中的应用
        1.3.3 TGase在纺织工业中的应用
    1.4 TGase基因工程菌株的研究现状
        1.4.1 大肠杆菌基因工程菌株的构建
        1.4.2 棒杆菌基因工程菌株的构建
        1.4.3 链霉菌基因工程菌株的构建
        1.4.4 其它基因工程菌株的构建
    1.5 大肠杆菌表达系统
        1.5.1 宿主菌株的选择
        1.5.2 载体的选择
        1.5.3 与其它蛋白共表达
        1.5.4 培养条件的控制
    1.6 巴斯德毕赤酵母表达系统
        1.6.1 毕赤酵母表达系统的组成
        1.6.2 影响外源蛋白表达的主要因素
    1.7 课题来源及研究内容
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 引物
        2.1.3 主要生化试剂
        2.1.4 仪器设备
        2.1.5 培养基
        2.1.6 常用试剂的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 黏玉米谷氨酰胺转氨酶基因的克隆
        2.2.2 重组表达载体pCold-tgz和pCold-ptgz的构建
        2.2.3 tgz在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的Western-Blot鉴定
        2.2.4 重组大肠杆菌的表达条件优化
        2.2.5 重组TGZ的分离纯化
        2.2.6 TGZ活性测定
        2.2.7 tgz基因密码子优化设计及全基因的合成
        2.2.8 重组表达载体pPIC9K-tgz和pPIC9K-tgzo的构建
        2.2.9 毕赤酵母的电击转化及转化子的筛选
        2.2.10 G-tgzo重组子产酶条件的优化研究
        2.2.11 不同来源TGase的性质研究和应用
    2.3 数据处理与统计分析
第3章 黏玉米TGase基因在大肠杆菌中的高效表达
    3.1 引言
    3.2 tgz基因的克隆
    3.3 重组表达载体pCold-tgz和pCold-ptgz的构建
    3.4 重组大肠杆菌的诱导表达及产物的Western-Blot鉴定
    3.5 重组大肠杆菌的表达条件优化
        3.5.1 宿主菌株的确定
        3.5.2 诱导培养基的确定
        3.5.3 IPTG诱导周期的确定
        3.5.4 IPTG诱导浓度的确定
        3.5.5 诱导前菌体生物量的确定
    3.6 重组TGZ的分离纯化
        3.6.1 包涵体的提取
        3.6.2 包涵体的复性和纯化
    3.7 tgz在大肠杆菌中表达的讨论
        3.7.1 叶绿体转移肽对TGZ表达的影响
        3.7.2 温度对TGZ表达的影响
        3.7.3 tgz在大肠杆菌中的高效表达
    3.8 本章小结
第4章 黏玉米TGase基因在毕赤酵母中分泌表达的研究
    4.1 引言
    4.2 tgz基因密码子优化
        4.2.1 tgzo基因的设计
        4.2.2 tgzo基因的合成
    4.3 tgz基因在毕赤酵母中的转化
        4.3.1 重组表达载体pPIC9K-tgz和pPIC9K-tgzo的构建
        4.3.2 毕赤酵母的电击转化及转化子的鉴定
    4.4 酵母重组子的诱导表达
        4.4.1 tgz基因在毕赤酵母中的分泌表达
        4.4.2 TGZ的分离纯化
        4.4.3 tgzo基因在毕赤酵母中的分泌表达及Western-Blot的鉴定
        4.4.4 TGZo的分离纯化
    4.5 tgz在毕赤酵母中分泌表达的讨论
        4.5.1 tgz基因的密码子优化
        4.5.2 SOEing-PCR法在tgzo合成过程中的应用
        4.5.3 tgz和tgzo基因在毕赤酵母中的表达
    4.6 本章小结
第5章 G-tgzo重组子产酶条件的优化研究
    5.1 引言
    5.2 G-tgzo重组子摇瓶发酵条件优化
        5.2.1 诱导培养基对TGZo表达的影响
        5.2.2 甲醇浓度对TGZo表达的影响
        5.2.3 甲醇诱导时间对TGZo表达的影响
        5.2.4 装液量对TGZo表达的影响
        5.2.5 诱导阶段pH对TGZo表达的影响
        5.2.6 诱导前菌体生物量对TGZo表达的影响
        5.2.7 油酸浓度对TGZo表达的影响
        5.2.8 PMT1浓度对TGZo表达的影响
    5.3 Plackett-Burman设计
    5.4 最陡爬坡试验
    5.5 中心组合试验
    5.6 G-tgzo重组子产酶条件优化研究的讨论
        5.6.1 单因素条件优化研究
        5.6.2 响应面优化研究
    5.7 本章小结
第6章 不同来源TGase的性质研究和应用
    6.1 引言
    6.2 不同来源TGase的酶学性质研究
        6.2.1 酶动力学参数测定
        6.2.2 最适反应温度
        6.2.3 温度稳定范围
        6.2.4 最适反应pH
        6.2.5 pH稳定范围
        6.2.6 金属离子对酶活性的影响
    6.3 不同来源TGase对不同底物蛋白交联作用的研究
        6.3.1 不同来源TGase对酪蛋白交联作用的研究
        6.3.2 不同来源TGase对乳清蛋白交联作用的研究
        6.3.3 不同来源TGase对大豆分离蛋白交联作用的研究
    6.4 不同来源TGase在酸奶中的应用研究
        6.4.1 不同来源TGase对酸奶质构的影响
        6.4.2 不同来源TGase对酸奶表观粘度的影响
        6.4.3 不同来源TGase对酸奶乳清析出量的影响
        6.4.4 不同来源TGase对酸奶蛋白质交联作用的影响
    6.5 不同来源TGase在酸奶中应用的讨论
    6.6 本章小结
结论
创新点
展望
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的论文及其它成果
致谢
个人简历

(6)汉滩病毒嵌合病毒样颗粒的制备及其免疫学特性研究(论文提纲范文)

缩略语表
中文摘要
Abstract
前言
    文献回顾
    1. HTNV 的基因组结构及其蛋白的免疫学特性
    2. HTNV 疫苗的研究现状
    3. VLP 疫苗的研究进展
第一部分 HTNVVLP 及嵌合有 CD40L 或 GM-CSFVLP 的制备、纯化及鉴定
    1 材料
        1.1 菌种、载体、病毒
        1.2 细胞
        1.3 工具酶
        1.4 抗体
        1.5 试剂
        1.6 培养液(基)与缓冲液
        1.7 仪器与器材
    2 方法
        2.1 分别含 HTNV M、S 及小鼠 CD40L、GM-CSF 基因的 rBV 的制备
        2.2 HTNV VLP、VLP-CD40L 及 VLP-GM-CSF 的制备、纯化及鉴定
        2.3 统计分析
    3 结果
        3.1 分别含 HTNV M、S 及小鼠 CD40L、GM-CSF 基因的 rBV 的制备结果
        3.2 HTNV VLP、VLP-CD40L 及 VLP-GM-CSF 的制备、纯化及鉴定结果
    4 讨论
第二部分 HTNVVLP 及嵌合有 CD40L 或 GM-CSFVLP 的生物学活性鉴定及免疫学特性研究
    1 材料
        1.1 病毒
        1.2 动物和细胞
        1.3 抗体
        1.4 主要试剂
        1.5 常用培养液
        1.6 主要仪器与器材
    2 方法
        2.1 HTNV VLP、VLP-CD40L 及 VLP-GM-CSF 的生物学活性鉴定
        2.2 HTNV VLP、VLP-CD40L 及 VLP-GM-CSF 诱导小鼠免疫应答的检测
        2.3 免疫小鼠的保护实验
        2.4 统计分析
    3 结果
        3.1 HTNV VLP、VLP-CD40L 及 VLP-GM-CSF 的生物学活性鉴定结果
        3.2 HTNV VLP、VLP-CD40L 及 VLP-GM-CSF 刺激小鼠免疫应答的检测结果
        3.3 免疫小鼠保护实验结果
    4 讨论
小结
参考文献
个人简历和研究成果
致谢

(7)人类肠道病毒71型与EB病毒疫苗候选抗原在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究(论文提纲范文)

论文创新点
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1 疫苗抗原表达系统
        1.1 疫苗抗原表达系统比较
        1.2 毕赤酵母表达系统
    2 EV71病毒研究现状
        2.1 EV71病毒
        2.2 EV71与手足口病
        2.3 EV71病毒预防策略
    3 EBV病毒研究现状
        3.1 EBV病毒
        3.2 EBV与肿瘤发生
        3.3 EBV及其相关疾病的防治方法
第二章 重组VP1蛋白诱导抗病毒免疫反应
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 溶液配制
        1.3 VP1真核表达载体的构建
        1.4 重组VP1表达菌株的构建与筛选
        1.5 重组蛋白的诱导表达及纯化
        1.6 BCA蛋白质定量分析
        1.7 SDS-PAGE与Western blot检测
        1.8 动物实验
        1.9 小鼠免疫血清中IgG和IgM水平检测
        1.10 小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应检测
        1.11 小鼠脾脏细胞因子检测
        1.12 外周血单核细胞的分离
        1.13 细胞计数
        1.14 流式细胞仪检测
        1.15 EV71病毒培养
        1.16 蔗糖密度梯度离心法分离纯化EV71病毒
        1.17 病毒中和实验
        1.18 小鼠被动保护实验
        1.19 统计学分析
    2 实验结果
        2.1 VP1密码子优化
        2.2 重组VP1的真核表达及纯化
        2.3 VP1诱导小鼠体液免疫反应
        2.4 病毒中和实验
        2.5 被动保护实验
        2.6 VP1刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖
        2.7 VP1刺激细胞因子水平的变化
        2.8 VP1促进小鼠脾脏和外周血T细胞的增多
    3 讨论
        3.1 重组VP1在毕赤酵母系统中高效表达
        3.2 重组VP1诱导小鼠体液与细胞免疫应答
        3.3 重组VP1作为EV71候选疫苗的应用前景
    4 本章小结
第三章 毕赤酵母表达的EBV核抗原EBNA1的免疫原性研究
    1 实验方法
        1.1 序列优化与合成
        1.2 真核表达载体的构建及鉴定
        1.3 重组表达菌株的构建与筛选
        1.4 重组E1△GA的真核表达和纯化
        1.5 BCA蛋白定量法
        1.6 细胞培养
        1.7 小鼠免疫实验
        1.8 ELISA检测小鼠免疫血清中IgG和IgM水平
        1.9 小鼠脾脏淋巴细胞的分离与培养
        1.10 淋巴细胞增殖实验
        1.11 免疫小鼠脾脏细胞因子检测
        1.12 外周血单核细胞的分离
        1.13 细胞计数
        1.14 流式细胞仪检测淋巴细胞亚群比例
        1.15 统计学分析
        1.16 序列提交
    2 实验结果
        2.1 E1AGA序列优化
        2.2 真核表达载体的构建与鉴定
        2.3 重组E1△GA的真核表达
        2.4 重组E1△GA的大量表达及纯化
        2.5 重组E1△GA诱导小鼠体液免疫反应
        2.6 E1△GA刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖
        2.7 E1△GA对脾脏细胞因子水平的影响
        2.8 E1△GA促进小鼠脾脏和外周血中T细胞的增多
    3 讨论
        3.1 在真核系统中成功大量表达E1△GA蛋白
        3.2 密码子优化能够提高外源蛋白表达水平
        3.3 重组E1△GA蛋白的免疫原性研究
        3.4 重组E1△GA作为EBV疫苗的应用价值
    4 本章小结
第四章 EBV包膜糖蛋白gp350在毕赤酵母中的表达
    1 实验方法
        1.1 EBV包膜糖蛋白gp350序列合成
        1.2 真核表达载体pPICZαA-gp350的构建
        1.3 重组表达载体的鉴定
        1.4 重组gp350表达菌株的构建及鉴定
        1.5 真核重组载体的诱导表达
        1.6 SDS-PAGE与Western blot检测
    2 实验结果
        2.1 gp350晶体结构与序列优化
        2.2 重组表达载体的构建
        2.3 重组gp350的诱导表达
    3 讨论
参考文献
攻博期间发表的科研成果
致谢

(8)基于iTRAQ技术的高效表达木聚糖酶重组毕赤酵母细胞的蛋白组学研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
目录
英文缩略词表
第一章 绪论
    1.1 蛋白质组学概述
    1.2. 蛋白质组学的研究方法
        1.2.1 荧光双向差异电泳技术(2D-DIGE)
        1.2.2 同位素亲和标签技术(ICAT)
        1.2.3 细胞培养稳定同位素技术(SILAC)
        1.2.4 可溶性聚合物同位素技术(SoPIL)
        1.2.5 同位素的相对和绝对定量技术(iTRAQ)
    1.3 毕赤酵母蛋白质组学的研究
        1.3.1 毕赤酵母简介
        1.3.2 毕赤酵母的优势
        1.3.3 毕赤酵母存在的问题和解决方案
        1.3.4 毕赤酵母高效分泌表达外源蛋白的主要策略
    1.4 木聚糖酶及其在毕赤酵母中的表达
        1.4.1 木聚糖酶简介
        1.4.2 木聚糖酶在造纸工业中的应用
        1.4.3 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达
    1.5 本课题研究背景与研究意义
    1.6 本课题的主要研究内容
第二章 高拷贝木聚糖酶表达载体的构建及基因拷贝数对酶在毕赤酵母中分泌表达的影响
    2.1 引言
    2.2 材料与设备
        2.2.1 质粒、菌株与引物
        2.2.2 主要仪器与设备
        2.2.3 主要试剂
        2.2.4 培养基与试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 单拷贝载体 pHKa-xyn10 的构建
        2.3.2 通过串联表达盒构建多拷贝重组质粒的构建
        2.3.3 利用 NTS 构建多拷贝表达载体的方法
        2.3.4 毕赤酵母的转化和重组菌株的筛选
        2.3.5 毕赤酵母的转化子拷贝数的鉴定
        2.3.6 不同拷贝数菌株的发酵产酶比较
        2.3.7 多拷贝菌株 xyn10 基因转录水平分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 两种方法构建多拷贝表达质粒与鉴定
        2.4.2 多拷贝木聚糖酶重组菌的筛选
        2.4.3 重组毕赤酵母拷贝数的鉴定
        2.4.4 拷贝数对木聚糖酶产酶的影响分析
        2.4.5 不同拷贝数菌株中目的基因转录水平的差异比较
    2.5 本章小结
第三章 过量表达内质网蛋白折叠相关基因对毕赤酵母分泌木聚糖酶的影响
    3.1 引言
    3.2 材料与设备
        3.2.1 质粒、菌株与引物
        3.2.2 主要仪器与设备
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 培养基与试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 胞内表达重组质粒的构建
        3.3.2 转化大肠杆菌感受态细胞
        3.3.3 大肠杆菌重组子筛选双酶切鉴定
        3.3.4 毕赤酵母重组菌株构建
        3.3.5 重组菌株与内质网蛋白折叠相关基因转录水平的分析
        3.3.6 2L 发酵罐进行高密度发酵
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 重组质粒构建与鉴定
        3.4.2 毕赤酵母重组菌株的筛选
        3.4.3 过表达与内质网蛋白折叠基因对四拷贝菌株发酵产酶的影响
        3.4.4 过表达与内质网蛋白折叠基因对七拷贝菌株发酵产酶的影响
        3.4.5 过表达 HAC1 基因对不同拷贝数菌株发酵产酶的影响
        3.4.6 G4-H 菌株在 2L 发酵罐的产酶比较
    3.5 本章小结
第四章 基于 iTRAQ 技术的高表达外源蛋白的毕赤酵母细胞的蛋白质组分析
    4.1 引言
    4.2 材料与设备
        4.2.1 质粒、菌株与引物
        4.2.2 主要仪器与设备
        4.2.3 主要试剂
        4.2.4 主要溶液的配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 重组毕赤酵母的培养
        4.3.2 毕赤酵母胞内蛋白的提取
        4.3.3 SDS-PAGE 和 Western blot 检测目的蛋白
        4.3.4 蛋白样品的烷基化处理和 Bradford 测定蛋白浓度
        4.3.5 蛋白质的消化及 iTRAQ 8 plex 试剂标记肽段
        4.3.6 标记肽段的强阳离子交换柱(SCX)分离
        4.3.7 质谱数据的生物信息学分析
        4.3.8 RT-PCR 验证差异表达蛋白质
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 重组菌株的发酵产酶及细胞胞内蛋白质组分析样品的制备
        4.4.2 蛋白样品 HPLC-MS/MS 上样前处理和定量分析
        4.4.3 iTRAQ 蛋白质组鉴定的谱图在毕赤酵母基因组中的匹配统计
        4.4.4 蛋白质组整体数据的分析
        4.4.5 不同菌株发酵产酶条件下细胞内的差异蛋白分析
        4.4.6 差异蛋白参与的 Pathway 代谢通路注释
        4.4.7 外源蛋白分泌表达诱导的 UPR 机制的研究
        4.4.8 外源蛋白分泌表达对碳源、能源及氨基酸代谢的影响
        4.4.9 RT-PCR 转录水平对差异蛋白的验证
    4.5 本章小结
结论与展望
    结论
    本论文创新点
    展望
参考文献
附录
攻读博士学位期间取得的研究成果
致谢
答辩委员会对论文的评定意见

(9)人血清白蛋白融合技术平台的共性与个性问题研究(论文提纲范文)

致谢
中文摘要
Abstract
缩写、符号清单、术语表
绪论
连接肽的引入对HSA/GH融合蛋白体外生物学活性、稳定性的影响研究以及HSA/GH融合蛋白的双抗夹心ELISA检测方法的建立
    前言
    实验仪器及材料
    实验方法
    实验结果
    实验讨论
    实验小结
HSA/PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的表达不均一性研究
    前言
    实验仪器及材料
    实验方法
    实验结果
    实验讨论
    实验小结
利用目的基因多拷贝整合以及分子伴侣共表达提高HSA融合蛋白在毕赤酵母中的表达量研究
    前言
    实验仪器及材料
    实验方法
    实验结果
    实验讨论
    实验小结
本论文最主要创新点
参考文献
作者简历及在读期间主要研究成果

四、汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达(论文参考文献)

  • [1]胰岛素受体与胰岛素样生长因子1受体结构的研究[D]. 张溪. 哈尔滨工业大学, 2020(02)
  • [2]粟酒裂殖酵母Ppr10-Mpa1复合体的制备[D]. 李琴. 南京师范大学, 2019(02)
  • [3]基于单B细胞的汉坦病毒全人源中和单抗的研制[D]. 张梦雄. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(02)
  • [4]传染性造血器官坏死病病毒参考蛋白的研制[J]. 王树云,高志强,张旻,谷强,任彤,刘艳华,江育林,张利峰. 水产学报, 2016(03)
  • [5]黏玉米谷氨酰胺转氨酶微生物异源表达及其酶学性质研究[D]. 李洪波. 哈尔滨工业大学, 2014(03)
  • [6]汉滩病毒嵌合病毒样颗粒的制备及其免疫学特性研究[D]. 程林峰. 第四军医大学, 2014(01)
  • [7]人类肠道病毒71型与EB病毒疫苗候选抗原在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究[D]. 王曼. 武汉大学, 2014(01)
  • [8]基于iTRAQ技术的高效表达木聚糖酶重组毕赤酵母细胞的蛋白组学研究[D]. 林小琼. 华南理工大学, 2013(05)
  • [9]人血清白蛋白融合技术平台的共性与个性问题研究[D]. 吴敏. 浙江大学, 2013(11)
  • [10]汉坦病毒包膜糖蛋白重组表达研究进展[J]. 呼延霆,薛小平,宋凯,汪桦. 实用医学杂志, 2009(20)

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汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达
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