黑龙江省哈尔滨市中医医院150076
摘要:目的:观察苦参碱对人皮肤癌A431细胞体外增殖、细胞周期的影响,探讨其对皮肤癌可能的作用机制。方法:MTT法检测苦参碱对人皮肤癌细胞增殖,流式细胞仪检测苦参碱对人皮肤癌细胞周期的影响。结果:苦参碱在0.5、0.75、1g/L浓度时均能明显抑制人皮肤癌A431细胞增殖,抑制率分别为13.35%、23.61%和41.47%,与对照组相比差异显著(P<0.01),IC50为1.21g/L。苦参碱0.5、0.75、1g/LG0/G1期细胞数量明显高于对照组,并呈浓度依赖关系。结论:苦参碱对人皮肤癌细胞有明显的生长抑制作用,且有剂量依赖关系;苦参碱可能是通过将人皮肤癌细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制其增殖,发挥其抗皮肤癌作用。
关键词:苦参碱;人皮肤癌细胞;细胞增殖;细胞周期;凋亡
Effectsofmatrineoncellproliferation,cellcycleofhumanskincancercelllineA431
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofmatrineoncellproliferation,cellcycleandapoptosisrateofhumanskincancercelllineA431.MethodsMTTwasusedtomeasureinhibitoryeffectsofmatrineongrowthofA431cells,flowcytometrywasusedtoanalyzethecellcycleandapoptosisrate.Results:MatrinecanobviouslyinhibitedthegrowthofA431attheconcentrationof0.5,0.75and1g/L,andtheinhibitingrateswere13.35%、23.61%and41.47%,respectively,whichwasinadose-dependentmanner,andthereweresignificantdifferenceincomparisonwiththecontrolgroup(P<0.01).IC50valuewas1.21g/L.ThenumberofA431cellsinG0/G1phaseofmatrinegroupsweresignificantlymorethanthatinthecontrolgroupandinaconcentration-dependentmanner.Conclusion:Matrinehadasignificantinhibitingeffectonhumanskincancercellsinanobviousdose-dependentmanner.MatrineinhibitedtheproliferationofthecellsbyblockingtheskincancercellcycletoG0/G1phase,anddevelopeditsanti-tumorfunctionbyinducinghumanA431cellsapoptosis.
Keywords:Matrine;humanskincancerA431cells;cellproliferation;cellcycle;apoptosis
引言
苦参系豆科植物苦参的干燥根。其含有多种生物碱,但主要为苦参碱和氧化苦参碱[1]。苦参碱具有抗病毒、抗心律失常、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等多种药理作用[2-5],广泛应用于临床。本文针对苦参碱对人皮肤癌细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡作用的影响,探讨其对皮肤癌可能的作用机制。
1材料和方法
1.1材料人皮肤癌细胞株A431购自中科院上海细胞库。
1.2试剂苦参碱(西安东华生物工程有限公司),顺铂(浙江海正药业),RPMI1640培养基(美国GIBCO产品);胎牛血清(杭州四季青);MTT、PI染料、DMSO均购自Sigma公司,AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京鼎国生物技术公司。
1.3仪器自动酶标仪550(日本BIO-RAD公司);倒置显徽镜(日本NIOKO公司);CO2孵箱(日本株式会社);流式细胞仪(美国Beckman公司);凝胶成像系统GIS-2019(上海Tannon公司)。
1.2方法
1.2.1细胞培养人皮肤癌A431细胞在RPMI-1640培养基(含10%FBS及1%青霉素-链霉素)中,于37℃、5%CO2、100%湿度条件下传代培养,3~4d传代1次。
1.2.2MTT法检测苦参碱对人皮肤癌细胞增殖的作用
人皮肤癌A431细胞经0.25%胰酶消化,调整细胞密度为5×105/L,按每孔100μL接种到96孔板内,培养24h后加入不同浓度(0.5、0.75、1g/L)苦参碱,继续培养72h。弃上清,每孔加100μL0.5g/L的MTT,继续培养4h后,每孔加200μL的DMSO,振荡摇匀,用酶标仪检测OD490值。同时设阴性对照组和阳性对照组(顺铂组),每组设6个复孔,重复3次。计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度(IC50)。
抑制率=(对照组平均OD值-加药组平均OD值)/对照组平均OD值×100%
1.2.2流式细胞术检测苦参碱对人皮肤癌细胞周期及凋亡率的影响
将对数生长期的A431细胞,以1×105/孔接种于6孔板中,随机分为对照组和实验组,实验组用苦参碱(0.5、0.75、1g/L)处理48h,胰酶消化收集细胞,用预冷的PBS缓冲液洗2次,1500r/min离心10min,预冷的75%乙醇固定,置于4℃冰箱过夜。次日用PBS洗2次,1500r/min离心10min,重悬于200μL的BindingBuffer中,加入10μL的AnnexinV-FITC后,室温避光15min。再加入PI染液避光染色30min,调整细胞浓度至1×109/L,流式细胞仪检测各细胞周期的百分比及细胞凋亡率。
1.2.3统计学分析
采用SPSS16.0统计软件进行数据分析,实验数据均以表示,采用方差分析及t检验。P<0.05,P<0.01为差异显著。
2结果
2.1苦参碱对人皮肤癌A431细胞增殖作用的影响
苦参碱组(0.5、0.75、1g/L)浓度组对人皮肤癌A431细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.01),且存在剂量依赖关系,其抑制率分别为13.35%、23.61%和41.47%,IC50为1.21g/L。
3讨论
苦参碱是中药苦参的主要活性成分,具有抗炎、抗纤维化、抗肿瘤等多种药理活性。研究表明,苦参碱对多种肿瘤细胞(如白血病细胞、人神经母细胞瘤、肺腺癌细胞等)均有明显的杀伤作用[6-8]。其抗肿瘤作用机制主要有抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞分化、凋亡,抑制肿瘤新生血管形成,逆转肿瘤细胞多重耐药等[1]。
本实验结果表明,苦参碱对人皮肤癌A431细胞有明显地生长抑制作用,并且可通过诱导人皮肤癌细胞凋亡并将细胞阻滞在G0/G1期,使细胞不能进入S期进行DNA的合成,最终使瘤细胞的体外增殖受到抑制。
参考文献:
[1]陈晓峡,向小庆,叶红.苦参碱及氧化苦参碱抗肿瘤作用的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(11):361-364.
[2]张彦,蒋纪恺,刘小珊,等.苦参碱诱导K562白血病细胞分化和凋亡的实验研究[J].癌症,2000,19(8):756.
[3]毛玲,薛天阳,许伟.苦参碱对人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞趋化因子受体4表达的影响[J].临床儿科杂志,2014,32(5):467-470.
[4]孟凡,张自翔,谢军,等.苦参碱对人肝癌细胞HepG2凋亡和PEG10表达的影响[J].实用医学杂志,2014,30(10):1523-1526.
[5]VikhrevaPN,ShepelevMV,KorobkoEV,etal.Pdcd4tumorsuppressorpropertiesfunctionsandpossibleapplicationsinOncology[J].MolGenMicrobiolVirusol,2010,25(2):3-11.
[6]宋庆林,江梅.苦参碱对白血病HL-60细胞增殖、凋亡及其Bcl-2mRNA、SurvivinmRNA表达的影响[J].山东医药,2014,54(15):30-32.
[7]罗娟,许伟,薛天阳,等.苦参碱对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用机制[J].实用儿科临床杂志,2012,27(3):190-191,214.
[8]周娟,倪松石,贲素琴.苦参碱对人肺腺癌A549细胞增殖及HIF-1α、VEGF表达的影响[J].山东医药,2012,52(3):25-27.