草鱼CHOP基因的克隆、表达及其转录调控分析

论文摘要

CHOP（又称DNA损伤诱导基因153（GADDl53））,作为生物体内普遍存在的一种转录调控因子,是C/EBP家族成员之一,在内质网应激介导的细胞凋亡中扮演着重要的作用。在本文中我们首先用同源基因克隆的方法克隆与鉴定了草鱼CHOP基因的全长cDNA序列（KX013389）及其启动子序列。CiCHOP cDNA全长1520bp,包括1个246bp的5′非翻译区、1个编码248个氨基酸的747bp的开放阅读框和1个527bp的3′非翻译区。CHOP蛋白在各物种中高度保守,其核心结构域均为“碱性亮氨酸拉链结构域（BRLZ）”。系统进化树分析显示,草鱼CHOP与其他鱼类分布在同一分支上具有较高的相似性,特别是与斑马鱼的进化关系显示最为接近。ATF4是细胞内质网应激中的关键调控因子。RT-PCR结果显示:不同浓度的衣霉素刺激均能诱导CiCHOP和CiATF4的表达上调。而随着刺激时间的增加,他们的表达量也出现明显上升并且表现出一致性,提示我们这两者之间可能存在一定的相互作用关系。为了进一步研究CHOP在外界刺激后的转录调控机制,我们克隆了CiCHOP的启动子序列并且原核表达和纯化了CiATF6和CiATF4蛋白。通过凝胶阻滞实验分析CiATF4和CiATF6与草鱼CHOP启动子之间的关系。结果显示,CiATF4和CiATF6均能够以高亲和力与CiCHOP的启动子结合,说明CiATF4和CiATF6是CiCHOP潜在的转录调控因子。双荧光素酶活性实验进一步研究CiATF4和CiATF6对CiCHOP的转录调控机制,构建了pGL3-CiCHOP的重组质粒并分别与pcDNA3.1-CiATF4、pcDNA3.1-CiATF6瞬时共转染到CIK细胞中。结果显示,ATF4和ATF6均能够显著上调草鱼CHOP的转录活性。细胞活性试验证明,在CIK细胞中CiCHOP的过表达能够引起细胞凋亡。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
•   1.1 内质网应激（ERS）概述
•     1.1.1 IRE1通路
•     1.1.2 ATF6通路
•     1.1.3 PERK-EIR2Α-ATF4-CHOP通路
•   1.2 转录激活因子ATF4
•     1.2.1 ATF4的历史与结构
•     1.2.2 ATF4的合成与降解
•     1.2.3 ATF4的生物学功能
•   1.3 CHOP
•     1.3.1 CHOP结构
•     1.3.2 CHOP表达调控
•     1.3.3 CHOP与细胞凋亡
•     1.3.4 CHOP与疾病的发生发展
•   1.4 研究目的与意义
• 第二章 材料和方法
•   2.1 仪器与试剂
•     2.1.1 主要仪器设备
•     2.1.2 主要试剂与试剂盒
•     2.1.3 载体、菌种与细胞株
•     2.1.4 引物表
•   2.2 相关软件
•   2.3 实验材料
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 草鱼CHOP全长cDNA的克隆
•     2.4.2 草鱼CHOP启动子的克隆
•     2.4.3 草鱼CHOP的系统进化分析
•     2.4.4 细胞培养
•     2.4.5 RT-PCR检测草鱼CHOP和ATF4在细胞中的表达水平
•     2.4.6 草鱼CHOP真核表达载体的构建
•     2.4.7 草鱼ATF4、ATF6与CHOP启动子亲和性分析
•     2.4.8 细胞转染与双荧光素酶分析
•     2.4.9 细胞活性检测
• 第三章 结果与分析
•   3.1 草鱼CHOP的克隆及其分析分析
•     3.1.1 草鱼CHOP全长cDNA的克隆及其分析
•     3.1.2 草鱼CHOP启动子的克隆及其分析
•   3.2 草鱼CHOP基因的系统进化分析
•   3.3 草鱼CHOP和ATF4基因表达分析
•   3.4 草鱼CHOP启动子与ATF4、ATF6的亲和性分析
•   3.5 草鱼ATF4、ATF6对草鱼CHOP的转录调控分析
•   3.6 细胞活性检测
• 第四章 讨论
•   4.1 草鱼CHOP基因的克隆及其进化分析
•   4.2 草鱼CHOP和ATF4基因表达分析
•   4.3 草鱼ATF4、ATF6对CHOP的转录调控分析
•   4.4 草鱼CHOP功能分析
• 第五章 主要结论、创新点及研究展望
•   5.1 主要结论
•   5.2 创新点
•   5.3 展望
• 致谢
• 参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李纪成

导师: 林刚

关键词: 内质网应激,转录调控,草鱼

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南昌大学

基金: 国家自然科学

分类号: Q953

总页数: 54

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