大白菜雌性不育突变基因Brfsm的克隆

论文摘要

大白菜（Brassica campestris ssp.pekinensis）基因组测序结果已于2011年释放,并经后续研究逐渐完善。揭示大白菜基因组中各个基因的功能与作用,是目前乃至今后一段时间内大白菜基因组研究的重要任务。大白菜为两性花植物,雌性不育突变体,是筛选和克隆雌蕊发育相关基因的理想材料。本研究以大白菜双单倍体纯系（DH系）‘FT’为试材,采用EMS诱变与小孢子培养相结合的方法,创制出一份雌性不育突变体fsm1（female-sterile mutant1）,其花粉有正常活力。遗传分析表明,突变性状呈单核基因隐性遗传。采用图位克隆策略,克隆了突变体fsm1的雌性不育突变基因Brfsm,探讨了突变基因Brfsm引起雌蕊败育的分子机制,主要研究结果如下。1.雌性不育突变体fsm1的表型特征和遗传特性利用浓度为0.08%（v/v）的EMS水溶液诱变处理分离纯化的大白菜小孢子,经常规的小孢子培养在再生植株的M1群体中,鉴定到一份雌性不育突变体fsm1,其花冠瘦小,但花朵开放后有花粉散出。扫描电镜观察显示,自交授粉后突变体雌蕊柱头上的花粉可以萌发,花粉管能够长入子房抵达胚珠部位,说明其雄配子发育是正常的。石蜡切片观察显示,突变体fsm1雌蕊子房内的中间隔膜融合异常,胚座框数量减少,胚囊结构不完整。遗传分析表明,突变体fsm1的雌蕊败育性状受单隐性核基因控制,遂定名为Brfsm。2.雌不育突变基因Brfsm的精细定位以与大白菜同属AA基因组的白菜薹DH系‘701’为母本,与雌不育突变体fsm1杂交,构建F2大规模基因定位群体。选取群体中3,108株表现突变形状的隐形纯合单株,通过筛选SSR连锁标记,将突变位点初步定位于大白菜A04染色体的cnu-m439a标记附近。进一步设计SSR和InDel标记,最终将突变基因Brfsm1定位在两个连锁标记Indel-I2和Indel-I7之间,遗传距离分别为0.05 cM和0.06 cM。经与参考基因组比对,该区间的物理距离为1376.69 kb,包含107个基因。经查对大白菜基因组数据库（BRAD）信息,发现该定位区间恰好在A04染色体的着丝粒附近。由于染色体的着丝粒附近存在复杂的结构域和异染色质结构,利用连锁标记分析方法难以进一步缩小定位区间。3.突变体fsm1基因组重测序预测候选基因通过对野生型‘FT’和突变体fsm1重测序,在雌不育突变体fsm中共检测到933,820个SNP,其中,落在定位目标区间内的有12个SNP,分布在6个基因上。经PCR扩增和Sanger测序,发现上述12个SNP中只有1个得到了验证,其发生在基因BraA04003010上,在野生型‘FT’中此位点碱基为鸟嘌呤（G）,而突变体fsm1中此位点碱基为胞嘧啶（C）,遗传密码由TCG（色氨酸）突变成TAG（终止密码子）,使基因BraA04003010编码氨基酸的CDS序列提前终止。推测BraA04001030为雌蕊败育候选基因。4.雌不育突变基因Brfsm的功能验证在本实验室拥有的同样以‘FT’为诱变材料,经EMS诱变处理萌动种子所构建的大白菜突变体库中（包含1,000多份突变体）,筛选到1份与雌不育突变体fsm1表型极为相似的雌不育突变体fsm2。遗传分析表明,突变体fsm2的雌不育性状也是受单隐性核基因调控的。为验证2份大白菜雌不育突变体fsm1和fsm2是否为同一基因突变所致,首先采用F1相互杂交方法进行等位性检测,发现其后代正常植株与雌不育植株均呈现3:1分离（分别为137:32和147:45）,说明fsm1和fsm2的雌不育突变基因为同一个基因。利用突变体fsm1的BraA04001030基因克隆引物,克隆突变体fsm2的对应基因,发现fsm2的BraA04001030基因上发生的一个SNP,由G变成了A,使CDS序列编码的氨基酸发生了错义突变,由GAA（谷氨酸）变成了GGA（甘氨酸）,引起蛋白质的氨基酸序列发生改变。大白菜BraA04001030基因的拟南芥同源基因AT5G35770编码STERILE APETALA（SAP）转录因子,对拟南芥花器官发育起调控作用。5.野生型‘FT’与突变体fsm1的转录组分析选取大白菜野生型‘FT’和雌不育突变体fsm1的雌蕊进行比较转录组分析,共获得1080个差异表达基因,鉴定到多个与花器官发育和胚珠形成相关的基因,包括ARF3/ETT,FIL,STM,ANT和KAN等,显著富集的GO terms主要与生物体的代谢过程相关。KEGG代谢通路富集分析,将709个差异表达基因比对到了95条代谢通路上,显著富集的代谢通路包括新陈代谢和次生代谢物合成等重要通路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词语表
• 前言
• 第一章 文献综述
•   1.1 植物雌性不育
•     1.1.1 植物雌性不育的类型及特征
•     1.1.2 植物雌性不育的形成原因
•     1.1.3 植物雌性不育的利用
•   1.2 雌蕊的发育
•   1.3 雌蕊发育的调控
•   1.4 胚珠的发育
•   1.5 胚珠发育的调控
•   1.6 本研究的目的与意义
• 第二章 大白菜雌性不育突变体fsm1 的创制及特征特性
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 诱变处理
•     2.1.3 扫描电镜观察
•     2.1.4 花粉管染色试验
•     2.1.5 石蜡切片
•     2.1.6 遗传特性分析
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 突变体的鉴定
•     2.2.2 雌不育突变体fsm1 的形态特征
•     2.2.3 柱头乳突细胞发育特征
•     2.2.4 花粉管发育特征
•     2.2.5 雌蕊的微观结构观察
•     2.2.6 突变体的遗传特性
•   2.3 小结
• 第三章 大白菜雌性不育突变基因Brfsm的定位
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 DNA提取及PCR反应
•     3.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
•     3.1.4 分子标记的开发与筛选
•     3.1.5 连锁分析与遗传图谱的构建
•     3.1.6 全基因组重测序
•     3.1.7 SNP的筛选和鉴定
•     3.1.8 候选基因的预测及验证
•     3.1.9 候选基因表达模式分析
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 多态性分子标记的筛选
•     3.2.2 与目的基因连锁标记的获得
•     3.2.3 突变基因的定位区间
•     3.2.4 雌不育突变基因Brfsm的精细定位
•     3.2.5 基因组重测序结果
•     3.2.6 定位区间内SNP的筛选与验证
•     3.2.7 候选基因的预测
•     3.2.8 候选基因的表达模式
•   3.3 小结
• 第四章 大白菜雌性不育突变基因Brfsm的功能验证
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 大白菜雌不育平行突变体的创制
•     4.1.2 突变体的形态特征观察
•     4.1.3 遗传特性分析
•     4.1.4 突变基因的等位性检测
•     4.1.5 DNA提取和基因克隆
•     4.1.6 候选基因的生物信息学分析
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 雌不育平行突变体fsm2 的形态特征
•     4.2.2 遗传特性
•     4.2.3 雌不育突变基因fsm1与fsm2 的等位性检测
•     4.2.4 雌不育突变基因fsm2 的测序比对
•     4.2.5 候选基因的生物信息学分析
•   4.3 小结
• 第五章 大白菜雌性不育突变体fsm1 的转录组分析
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 植物材料
•     5.1.2 RNA提取
•     5.1.3 cDNA文库构建和HiSeq测序
•     5.1.4 测序数据过滤与参考序列比对分析
•     5.1.5 基因表达水平分析和差异表达基因的筛选
•     5.1.6 qRT-PCR分析
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 转录组测序数据质量
•     5.2.2 参考序列比对分析
•     5.2.3 差异表达基因的筛选
•     5.2.4 差异表达基因的GO功能富集分析
•     5.2.5 差异表达基因的KEGG代谢途径分析
•     5.2.6 花器官和胚珠发育相关差异表达基因的分析
•     5.2.7 基因表达模式分析
•   5.3 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘文杰

导师: 冯辉

关键词: 大白菜,雌性不育,图位克隆,转录因子

来源: 沈阳农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 沈阳农业大学

分类号: S634.1;Q943.2

DOI: 10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000085

总页数: 95

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