水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的多层次翻译调控

论文摘要

水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）第二组成员,引起水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病等。RBSDV基因组包括十条双链RNA（dsRNA）,5’端具有帽子结构（m7GPPPN）,3’末端没有poly（A）尾结构,共编码13种蛋白;其中S5、S7、S9各自编码两个蛋白,属于双顺反子RNA,其余链是单顺反子RNA,各编码一个蛋白。RBSDV基因组的10条双链RNA的5’和3’末端各自存在十分保守的序列,且紧邻5’和3’端的序列存在潜在的碱基互补配对。本文研究RBSDV单顺反子RNA的非编码区对翻译的调控作用及机制;RBSDV双顺反子RNA的蛋白表达特性以及调控第二个蛋白表达的顺式作用元件。利用萤火虫荧光素酶（Fluc）报告基因载体和定点突变分析,探究RBSDV单顺反子RNA S3和S10的的非编码区对翻译的调控作用及机制。结果表明:（1）S3和S10的5’UTR在有无帽子时均可以正向调控报告基因Fluc的翻译,表现核糖体内部进入位点（IRES）活性;且5’UTR的基因组间保守序列及邻近序列均参与IRES活性;（2）对应的3’UTR则抑制5’UTR对翻译的正调控效应,其分子基础是5’UTR和3’UTR之间的RNA-RNA互作;且该RNA-RNA互作也抑制帽子依赖型翻译的效率。利用35S标记的体外翻译体系同步分析RBSDV基因组双顺反子S7与S9分别编码的两个蛋白的表达情况及比例;然后利用萤火虫荧光素酶（Fluc）报告基因载体和定点突变分析初步定位第二个蛋白翻译调控的顺式作用元件。结果表明:（1）S7和S9各自编码的2个蛋白都可以从基因组表达,暗示这2个双顺反子RNA的第二个蛋白的表达模式是内部起始。S7编码的第二个蛋白P7b的表达量约为第一个蛋白P7a的4.7%;而S9编码的第二个蛋白P9b的表达量约为第一个蛋白P9a的18.8%;（2）S9编码的P9a与P9b的基因间隔区（IGR）中存在2个小的ORF;由于这2个小ORF消失时P9b的蛋白表达量提高约73.4%,表明2个小ORF的存在降低了P9b的蛋白表达效率;（3）S7和S9的IGR具备弱IRES活性;且相应的3’UTR可以协同提高IGR的IRES活性。综合两部分的研究结果,发现3’UTR在单顺反子RNA的翻译调控中起抑制作用,而在双顺反子的第二个蛋白的翻译调控中起促进作用。暗示3’UTR可能是双顺反子RNA调控2个蛋白表达比例的关键区段。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
•   1.1 水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）
•     1.1.1 寄主、症状及致病机制
•     1.1.2 传播介体及方式
•     1.1.3 分类及粒子形态特征
•     1.1.4 基因组结构及功能
•   1.2 植物RNA病毒基因组的翻译调控策略
•     1.2.1 具有5'IRES元件的植物RNA病毒的翻译调控
•     1.2.2 具有3'CITE元件的植物RNA病毒的翻译调控
•   1.3 研究目的及意义
• 2 材料和方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 质粒和菌株
•     2.1.2 载体及试剂
•     2.1.3 主要实验仪器
•     2.1.4 引物合成和测序
•   2.2 方法
•     2.2.1 聚合酶链式反应（PCR）
•     2.2.2 重叠PCR反应
•     2.2.3 核酸的沉淀和浓缩
•     2.2.4 PCR产物或酶切产物的胶回收
•     2.2.5 连接反应
•     2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
•     2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的转化
•     2.2.8 菌落PCR筛选重组质粒
•     2.2.9 酶切反应
•     2.2.10 碱裂解法提取质粒
•     2.2.11 体外转录制备5'不加帽RNA
•     2.2.12 体外转录制备5'加帽RNA
•     2.2.13 麦胚提取物（Wheat Germ Extract）中的体外翻译及检测
•     2.2.14 体外翻译中35S标记蛋白表达反应及检测
• 3 结果与分析
•   3.1 RBSDV单顺反子基因组S3、S10 的翻译调控研究
•     3.1.1 S3和S10的5'UTR正向调控帽子依赖型和不依赖帽子的翻译
•     3.1.2 S3和S10的3′UTR与5′UTR的RNA-RNA互作抑制不依赖帽子的翻译
•     3.1.3 S33'UTR与5'UTR的 RNA-RNA互作对帽子依赖型翻译的抑制
•   3.2 RBSDV双顺反子基因组S7、S9 的翻译调控研究
•     3.2.1 RBSDV双顺反子S7、S9 的蛋白表达
•       3.2.1.1 双顺反子S7的P7a、P7b蛋白表达
•       3.2.1.2 双顺反子S9的P9a、P9b蛋白表达
•     3.2.2 双顺反子基因间隔区（IGR）对翻译的调控作用
•       3.2.2.1 S7 的基因间隔区（IGR）对翻译的调控作用
•       3.2.2.2 S9 的基因间隔区（IGR）对翻译的调控作用
• 4 讨论
•   4.1 RBSDV单顺反子基因组的翻译调控研究
•   4.2 RBSDV双顺反子基因组S7,S9 第二个蛋白的翻译调控机制
• 5 结论
• 参考文献
•   附表1 引物列表
•   附表2 质粒列表
• 致谢
• 硕士期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 袁婷

导师: 原雪峰

关键词: 水稻黑条矮缩病毒,帽子,顺反子,标记,翻译调控

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护

单位: 山东农业大学

分类号: S432.41

总页数: 55

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