新一代工业微生物生物网络模型的构建及应用

论文摘要

生物网络模型作为一种系统生物学工具,被广泛地应用在微生物表型相关的研究中。本文围绕生物网络的发展历程,通过对已发表的代谢模型进行收集与整理,利用常见的LAMP架构搭建了工业微生物代谢网络模型数据库（IMGMD）,实现了第一代生物网络模型的标准化;从IMGMD数据库收录的代谢模型中,选取典型工业微生物作为研究对象,分别构建了大肠杆菌K12的酶约束模型（eciML1515）和酿酒酵母S288C的全细胞网络模型（WMS288C）。利用已构建的第二代生物网络,实现了微生物表型的精准预测。在此基础上,开发了一系列策略对大肠杆菌赖氨酸生产性能进行了优化。主要研究结果如下:1.通过对已有的模型数据库和文献数据库挖掘,收集和整理已有的工业微生物代谢网络模型。分别针对代谢模型包含的反应列表和代谢物列表,对其标准化,统一转换为EXCEL格式,能够直接被COBRA工具箱读取和分析,最终得到包含139种微生物的329个代谢模型,涵盖7948个代谢物和20849个生化反应。采用LAMP（Linux+Apache+MySQL+PHP）架构,搭建了工业微生物代谢网络模型数据库IMGMD（http://imgmd.jiangnan.edu.cn/database）。实现了标准模型检索、模型快速构建、生化途径挖掘和突变靶点筛选等功能。数据库自2016年上线以来,已经被来自16个国家和地区的用户访问2300余次。2.在最新发表的大肠杆菌代谢模型iML1515的基础上,采用GECKO方法,将BRENDA数据库中酶学性质引入代谢模型,构建了大肠杆菌酶约束模型eciML1515。该模型涵盖了1286个蛋白的酶学性质(分子量、kcat值等),与iML1515相比,反应和代谢物数目分别增加了125.0%和92.3%。在0.15 h-1、0.2 h-1、0.25 h-1、0.3 h-1、0.35 h-1和0.4 h-1稀释率下的模拟值能够与恒化培养数据吻合。模拟了在24种不同培养条件下的生长比速率,GECKO方法得到的皮尔森相关系数为0.57（p-value=0.03）。进一步模拟92种碳源、51种氮源、16种磷源和12种硫源培养条件下的生长情况,得到的准确性分别为95.7%、82.4%、100%和66.7%;必需基因模拟结果表明,在至少1种条件下,415个基因被鉴定为的必需基因;在16种条件下,183个基因被鉴定为必需基因;190个基因被鉴定为只在特定1种条件下的必需基因,最终在16种条件下的必需基因预测准确性为92.7%。选取3种氨基酸和3种有机酸作为目标产品,基于eciML1515分析大肠杆菌对这些产品的合成能力。3.基于eciML1515模型预测出20个代谢改造靶点,在前期实验室通过诱变育种得到赖氨酸生产菌株大肠杆菌CCTCC M2019435的基础上,对这些靶点进行实验验证。发现过量表达二氢硫辛酰胺脱氢酶基因lpdA、黄素还原酶基因fre、乙酰辅酶A合成酶基因acs、二氨基二甲酸脱羧酶基因lysA和天冬氨酸激酶基因lysC,赖氨酸产量分别提高了63.8%、108.7%、55.6%、50.0%和123.6%。这些基因涉及前体物质积累、产物合成路径强化和能量供给三个方面。利用RBS调控方法,对fre和lysC的表达水平进行组合优化,分别维持在高表达和中表达水平,赖氨酸产量达到了95.7±0.7 g·L-1,提高了169.1%。模拟结果和7.5-L发酵罐实验表明,NH4+作为氮源时,赖氨酸产量最高,与尿嘧啶、硝酸盐、亚硝酸盐和尿素作为氮源相比,分别提高了69.4%,19.8%,15.9%和28.2%。维持发酵罐中氨基氮浓度在0.15%水平时,产量达到了123.7±1.5 g·L-1。动态FBA的模拟结果表明,随着氧气吸收速率的增加,发酵周期缩短了47.7%,赖氨酸合成速率提高了107.7%。实验结果证实高溶氧条件（50%）下,赖氨酸产量增加至193.6±1.8 g·L-1,提高了55.8%。4.将酿酒酵母复杂的胞内活动模块化成26个细胞过程,并且用不同的数学模型来表示。例如用流量平衡分析表示代谢过程、布尔逻辑来表示染色质分离、皮尔森系数表示RNA降解。通过15个细胞状态将这些亚模型整合,得到了酿酒酵母S288C的全细胞网络模型WMS288C。接着分别从准确性和可重复性对WMS288C模型进行验证。利用WMS288C预测酿酒酵母的表型,从5个水平（DNA、RNA、蛋白质、代谢物和形态）对1140个必需基因的功能进行了表征,实现了基因型与表型的关联;在一个细胞周期内,可以实时预测细胞内分子的动态分配,模拟出26个细胞过程中的辅因子需求;此外,1/3的非必需基因被鉴定为通过调节核苷酸浓度来影响细胞生长。cAMP信号通路是胞内核苷酸调控的关键途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 第一代生物网络模型的发展
•     1.1.1 典型代谢模型
•     1.1.2 互作网络模型
•     1.1.3 泛基因组模型
•     1.1.4 宏基因组模型
•   1.2 第二代生物网络模型的发展
•     1.2.1 组学数据整合
•     1.2.2 约束条件添加模型
•     1.2.3 生物模型整合
•     1.2.4 全细胞模型
•   1.3 生物网络模型的分析
•     1.3.1 模型构建
•     1.3.2 模型分析
•   1.4 生物网络模型的应用
•     1.4.1 分析网络特性
•     1.4.2 预测细胞表型
•     1.4.3 指导菌株设计
•     1.4.4 驱动模型发现
•     1.4.5 研究进化过程
•     1.4.6 分析相互作用关系
•   1.5 本论文的研究内容
•     1.5.1 利用生物网络预测微生物表型面临的科学问题
•     1.5.2 本论文主要研究内容
• 第二章 工业微生物代谢网络模型数据库的搭建与应用
•   2.1 前言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 数据获取
•     2.2.2 数据处理
•     2.2.3 数据库平台的搭建
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 数据的收集与整理
•     2.3.2 数据库的内容及网页界面
•     2.3.3 数据库的功能介绍
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• i ML1515 的构建及特征分析'>第三章 大肠杆菌酶约束模型ec_i ML1515 的构建及特征分析
•   3.1 前言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 数据收集
•     3.2.2 软件使用
•     3.2.3 酶学性质与模型整合
•     3.2.4 网络特性分析
•     3.2.5 模拟分析
•   3.3 结果与讨论
• i ML1515 的构建'>    3.3.1 大肠杆菌酶约束模型ec_i ML1515 的构建
• i ML1515 的特征分析'>    3.3.2 大肠杆菌酶约束模型ec_i ML1515 的特征分析
• i ML1515 的验证'>    3.3.3 大肠杆菌酶约束模型ec_i ML1515 的验证
• i ML1515 模型分析大肠杆菌表型'>    3.3.4 基于ec_i ML1515 模型分析大肠杆菌表型
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• i ML1515 提高赖氨酸产量'>第四章 基于大肠杆菌酶约束模型ec_i ML1515 提高赖氨酸产量
•   4.1 前言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 恒化培养模拟
•     4.2.2 分批培养模拟
•     4.2.3 基因敲除模拟
•     4.2.4 蛋白需求性计算
•     4.2.5 OptForce模拟
•     4.2.6 动态FBA模拟
•     4.2.7 菌株与质粒
•     4.2.8 仪器与试剂
•     4.2.9 培养条件
•   4.3 结果与讨论
• i ML1515 模型鉴定赖氨酸过量生成靶点'>    4.3.1 基于ec_i ML1515 模型鉴定赖氨酸过量生成靶点
•     4.3.2 代谢工程改造大肠杆菌提高赖氨酸产量
•     4.3.3 氮源代谢优化促进赖氨酸生产
•     4.3.4 强化氧化磷酸化水平促进赖氨酸生产
•   4.4 讨论
•     4.4.1 代谢模型在指导代谢工程中的应用
•     4.4.2 基于生物网络优化营养供给提高目标产物
•   4.5 本章小结
• 第五章 酿酒酵母全细胞模型的构建及其在表型预测中的应用
•   5.1 前言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 计算机配置
•     5.2.2 软件分类
•     5.2.3 数据库列表
•     5.2.4 数据的收集与整理
•     5.2.5 全细胞模型的构建
•     5.2.6 数据库的存储与管理
•     5.2.7 全细胞模型的验证
•   5.3 结果与讨论
• S288C的构建及特征分析'>    5.3.1 酿酒酵母全细胞模型WM_S288C的构建及特征分析
• S288C的验证'>    5.3.2 酿酒酵母全细胞模型WM_S288C的验证
•     5.3.3 基于酿酒酵母全细胞模型分析基因型表型相互作用关系
•     5.3.4 基于酿酒酵母全细胞模型计算单个细胞周期内的资源分配
•     5.3.5 基于酿酒酵母全细胞模型鉴定胞内核苷酸调控机制
•   5.4 讨论
•   5.5 本章小结
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文
• 附录Ⅱ:赖氨酸合成阶段蛋白合成速率增加的蛋白
• 附录Ⅲ:赖氨酸合成阶段蛋白合成速率下降的蛋白

文章来源

类型: 博士论文

作者: 叶超

导师: 刘立明

关键词: 生物网络模型,工业微生物,酿酒酵母,全细胞网络模型,大肠杆菌,酶约束模型

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学

基金: 国家重点研发计划(2018YFA0901401),2018年“万人计划”科技创新领军人才,国家自然科学基金(No.21808083)

分类号: Q811.4

DOI: 10.27169/d.cnki.gwqgu.2019.000034

总页数: 121

文件大小: 10245K

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