大豆天隆一号突变体库及CRISPR/Cas9技术平台的初步构建

论文摘要

大豆【Glycine max（L.）Merr.】属于豆科、蝶形花亚科、大豆属,是目前世界范围内种植较广的重要经济作物之一,是植物蛋白的主要来源,也是植物油脂的来源之一。由于大豆是古四倍体,大约有75%的基因是以同源基因的形式表现的,其基因组结构复杂和遗传转化效率低等原因限制了其功能基因组研究的发展。随着大豆基因组测序的初步完成,大豆功能基因组研究也逐渐成为研究的重点。突变体是基因功能研究的重要材料,也是大豆遗传育种改良的基础材料。因此,本研究利用60Coγ射线和甲基磺酸乙酯处理大豆“天隆一号”以构建大豆突变体库以及以花发育相关基因Gm PTL和Gm AP1为基础构建CRISPR/Cas9技术平台编辑大豆,获得大豆花发育相关的突变体。具体实验结果如下:1.大豆突变体库的构建对诱变后的大豆“天隆一号”种子的M2和M3代的突变体进行表型性状的调查和统计,进一步筛选分析获得了包括株型、叶、花、茎、荚等性状变异的材料140份。其中获得叶变异材料63份,株型变异材料75份,花变异材料11份,荚变异材料18份;种子变异材料50份,熟期变异材料28份。同一株系存在有不同变异性状。2.分子标记鉴定从大豆基因组数据库中挑选出60对近似于平均分布在20对染色体上的大豆SSR分子标记引物对138个实验材料进行分析,有26对引物能够扩增出差异性条带,总共有105份材料被检测出存在SSR差异性,在分子水平上证明这些材料发生了突变。3.CRISPR/Cas9技术平台的构建（1）以拟南芥的ptl和AP1基因的蛋白序列为基础序列,在soybase.org数据库中比对大豆数据库,与之同源性最高的命名为Gm PTL和Gm AP1。通过q PCR检测,发现相对于叶片,Gm PTL和Gm AP1在大豆花和萼片中特异性表达。并在其外显子上设计了三个CRISPR/Cas9靶向位点分别为Gm PTL-1、Gm PTL-2和Gm AP1-1。（2）构建了Gm PTL和Gm AP1基因敲除的载体p HEE401E-Gm PTL-1、p HEE401E-Gm PTL-2和p HEE401E-Gm AP1-1,并将其转化入农杆菌K599中,并利用农杆菌介导法转化大豆子叶,证明了构建的载体是能够实现在大豆发状根中基因的定点编辑。（3）针对农杆菌菌株和激素浓度优化农杆菌介导转化大豆子叶节体系,农杆菌LBA4404表现出较好且较稳定的转化效率。将载体p HEE401E-Gm PTL-1、p HEE401E-Gm PTL-2和p HEE401E-Gm AP1-1转化入农杆菌LBA4404中,通过优化后的根癌农杆菌介导的子叶节转化体系对大豆基因组进行编辑,获得了T1代株系7株。（4）用特异性引物扩增7株T1代株系靶位点附近碱基序列,发现共有6株大豆的基因发生了编辑,分别是T2000-1、T2000-1a、T2000-3、T2000-4、T2000-5、T2000-6。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 植物突变体库研究进展
•     1.1.1 自发突变
•     1.1.2 物理辐射诱变
•     1.1.3 化学试剂诱变
•     1.1.4 生物学技术诱变
•   1.2 大豆突变体库研究进展
•     1.2.1 大豆理化诱变研究进展
•     1.2.2 CRISPR/Cas9 技术在大豆基因敲除中的研究进展
•     1.2.3 大豆转基因技术的进展
•     1.2.4 植物花形态发育研究进展
•   1.3 本课题的研究内容和意义
• 第2章 大豆突变体库的构建
•   2.1 材料与试剂
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验耗材和仪器
•     2.1.4 实验溶液的配置
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 诱变处理
•     2.2.2 播种与收获
•     2.2.3 表型调查
•     2.2.4 SSR分子检测
•     2.2.5 RT-qPCR基因表达分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 诱变效应分析
•     2.3.2 性状分析
•     2.3.3 突变体的SSR分子标记检测
•     2.3.4 RT-qPCR分析
•   2.4 讨论
• 第3章 CRISPR/Cas9 技术平台的构建
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 菌株和质粒
•     3.1.3 实验试剂
•     3.1.4 培养基和培养液配方
•     3.1.5 实验耗材和仪器
•     3.1.6 PCR扩增所用的引物列表
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 构建载体
•     3.2.2 载体的转化
•     3.2.3 农杆菌介导的大豆子叶节转化
•     3.2.4 发根农杆菌K599 诱导毛状根
•   3.3 结果与分析:
•     3.3.1 靶点的选择
•     3.3.2 重组质粒转化农杆菌的鉴定
•     3.3.3 发根农杆菌诱导“天隆1 号”大豆发状根的检测
•     3.3.4 根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化
•     3.3.5 小结与讨论
• 第4章 结论
• 第5章 创新点和展望
•   5.1 本研究的创新点
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张鑫

导师: 朱骏,王彪

关键词: 大豆,天隆一号,理化诱变,基因编辑

来源: 上海师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 上海师范大学

分类号: S565.1;Q943.2

总页数: 88

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