Ⅱa类细菌素抗性的产生及机理研究

论文摘要

本文以Ⅱa类细菌素及其敏感菌李斯特菌为主要研究对象。首先提取获得具有生物学活性的Ⅱa类细菌素,通过诱导获得抗性的李斯特菌,比较敏感菌株与抗性菌株在生长代谢上的差异,继而进一步研究其抗性产生的机理。研究结果有利于阐明细菌素的作用机制,为其未来在食品中的应用提供理论依据,为后续相关研究提供参考。本文主要内容如下:1.提取细菌素并测定抑菌活性。分别采用硫酸铵沉淀法、酸沉淀法、Yang氏吸附法对植物乳杆菌、弯曲乳杆菌和乳酸片球菌的细菌素进行提取。植物乳杆菌素的最适提取方法是硫酸铵沉淀法,在硫酸铵浓度为70%时提取效果最佳。乳酸片球菌和弯曲乳杆菌细菌素最适提取方法为Yang氏吸附法。单核细胞增生李斯特菌、伊氏李斯特菌和无害李斯特菌对上述三种细菌素均表现出敏感性,其中以单增李斯特菌做为指示菌测定的乳酸片球菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌细菌素的效价分别为640 AU/mL、320 AU/mL和320 AU/mL。2.抗性菌株的诱导及抗性分析。采用片球菌素诱导单核细胞增生李斯特菌,抗性产生频率为10-5,得到两株具有稳定抗性的菌株。牛津杯法测定细菌素活性,结果显示抗性菌株对含有细菌素的中和发酵上清液不敏感,但对nisin的敏感性无变化;通过测定菌株生长曲线发现,在不含片球菌素的条件下,原始菌株在对数期生长速率高于抗性菌株,抗性菌株对数期延后且最终菌液浓度高于原始菌株。当含有不同浓度片球菌素时,原始菌株被明显抑制,而抗性菌株仍表现出生长趋势,但出现菌液浓度低于未添加片球菌素的情况;原始菌株利用葡萄糖和甘露糖时达到稳定期的时间快于抗性菌株,而抗性菌株利用纤维二糖后生长速率更快。3.抗性机理研究。测定了菌株细胞表面疏水性、细胞对溶菌酶敏感性、菌体自身吸附作用、菌株分泌酶作用和调控基因的验证等,结果显示随着抗性的产生,菌株细胞表面疏水性提高;生物成膜性随抗性的产生而降低;抗性菌株对细菌素的吸附能力下降,对溶菌酶敏感性无明显差异,且不能分泌使细菌素失活的酶类。对菌株中两个调控基因lmo0095和resD进行扩增后,测序结果表明,原始菌株与抗性菌株中的序列一致。4.目的基因在重组菌中的克隆表达。将甘露糖磷酸转移酶系统的mptC和mptD基因扩增,分别获得大小约800 bp和900 bp的目的片段,连接T载体构建重组克隆质粒pMD19-mptC和pMD19-mptD,同时分别与双酶切的pET32a（+）和pNZ8048载体连接、转化,构建重组表达质粒pET32a-mptC/pET32a-mptD,pNZ8048-mptC/pNZ8048-mptD。pET32a-mptC/pET32a-mptD转化宿主菌大肠杆菌B121（DE3）后得到重组蛋白TrxA-MptC、TrxA-MptD,经IPTG诱导后,出现分子质量约为50 kDa的重组蛋白条带。pNZ8048-mptC/pNZ8048-mptD电转化乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞,成功获得重组菌株。通过nisin诱导后测定生长曲线,NZ9000（pNZ8048-mptC）菌株生长速率及生长量均随nisin诱导浓度的提高而增高,当诱导浓度为10 ng/mL时生长情况最佳;NZ9000（pNZ8048-mptD）菌株在5 ng/mL的nisin诱导浓度时生物量最高。当存在细菌素时,高浓度（≥5 ng/mL）nisin诱导后的重组菌株生长受到抑制,并均对细菌素表现出敏感性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
•   1.1 乳酸菌细菌素概述
•     1.1.1 乳酸菌细菌素的分类
•     1.1.2 IIa类细菌素的特点
•     1.1.3 乳酸菌细菌素在食品中的应用
•   1.2 细菌素的提取
•     1.2.1 硫酸铵沉淀法
•     1.2.2 吸附法
•     1.2.3 酸沉淀法
•     1.2.4 有机溶剂抽提法
•   1.3 细菌素的作用机制
•     1.3.1 Ⅰ类细菌素作用机制
•     1.3.2 Ⅱ类细菌素作用机制
•     1.3.3 Ⅲ类细菌素作用机制
•   1.4 细菌素抗性的研究现状
•   1.5 目的基因在原核表达系统中的重组表达
•     1.5.1 大肠杆菌表达系统
•     1.5.2 乳酸菌表达系统
•     1.5.3 枯草芽孢杆菌表达系统
•   1.6 研究的目的及意义
•     1.6.1 立题目的与意义
•     1.6.2 主要研究内容
• 第二章 细菌素的提取和抑菌活性的测定
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料与试剂
•     2.1.2 仪器与设备
•     2.1.3 方法
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 细菌素提取及活性测定结果
•     2.2.2 李斯特菌对不同发酵上清敏感性分析
•   2.3 小结
• 第三章 抗性菌的产生及生长特性分析
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 材料与试剂
•     3.1.2 仪器与设备
•     3.1.3 方法
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 抗性菌的产生
•     3.2.2 抗性验证和稳定性测定结果
•     3.2.3 最小抑菌浓度的测定结果
•     3.2.4 生长曲线测定结果
•   3.3 小结
• 第四章 抗性机理的研究
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 材料与试剂
•     4.1.2 仪器与设备
•     4.1.3 方法
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 疏水性测定结果
•     4.2.2 菌株对溶菌酶敏感性测定结果
•     4.2.3 细菌素的吸附作用结果
•     4.2.4 菌株自身分泌酶实验结果
•     4.2.5 生物膜测定结果
•     4.2.6 调控基因的验证结果
•   4.3 小结
• 第五章 Man-PTS基因的克隆与表达
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 材料与试剂
•     5.1.2 仪器与设备
•     5.1.3 方法
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 基因扩增结果
•     5.2.2 重组克隆质粒pMD19T-mptC/D的构建
•     5.2.3 重组表达质粒pET32a-mptC/D的构建和鉴定
•     5.2.4 重组基因mptC/D在大肠杆菌中的诱导表达
•     5.2.5 重组表达质粒pNZ8048-mptC/D构建和鉴定
•     5.2.6 重组基因mptC/D在乳酸菌中的诱导表达
•   5.3 小结
• 结论
• 试验不足与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘勇君

导师: 张平平

关键词: 细菌素,李斯特菌,抗性,基因克隆,重组蛋白

来源: 天津农学院

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 天津农学院

分类号: TS201.3

总页数: 60

文件大小: 6643K

下载量: 27