（1宁夏医科大学临床学院宁夏银川750004）
（2宁夏医科大学基础医学院宁夏银川750004）
【摘要】目的:探讨MST1((mammaliansterile20-likekinase1)在同型半胱氨酸致血管内皮细胞损伤中的作用。方法：将人脐静脉血管内皮细胞(HuVECs)分为正常对照组(0μmol/LHcy)、同型半胱氨酸组(100μmol/LHcy)和干预组(100μmol/LHcy+叶酸+维生素B12)，48h后收集细胞，采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及Westernblot分别检测MST1mRNA和蛋白表达水平，MTT法检测血管内皮细胞活性。结果：与正常对照组相比，Hcy组MST1的mRNA及蛋白表达水平明显增高（P<0.01，P<0.05），内皮细胞活性明显降低（P<0.01），与Hcy组相比，Hcy+叶酸+维生素B12组MST1的mRNA及蛋白表达水平明显降低（P<0.01，P<0.01），内皮细胞活性明显升高（P<0.01）。结论：MST1参与了Hcy导致的血管内皮细胞损伤，叶酸+维生素B12能够减轻Hcy导致的血管内皮细胞损伤。
【关键词】动脉粥样硬化；血管内皮损伤；MST1；同型半胱氨酸
【中图分类号】R543【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2017）20-0185-03
同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代谢的中间产物，严重的动脉粥样硬化病变往往伴随高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia，HHcy）[1]，因此深入研究HHcy的发生机制已成为As研究领域的重要课题。HHcy的机制包括加速血栓形成、内皮细胞(HuVECs)损伤、炎性反应、氧化应激、血管平滑肌细胞(VSMC)激活与增殖、血管重建等[2]。血管内皮功能损伤是Hcy致As的起始因素[3]，但具体机制不清。蛋白激酶(mammaliansterile20-likekinase,MST)是由多种组织产生的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[4]，同时调控细胞周期与细胞凋亡。但MST1是否参与了Hcy导致的血管内皮细胞损伤，尚不清楚。因此本研究用Hcy进行血管内皮细胞，观察MST1的表达，为临床HHcy致As相关疾病的防治提供新策略。
1.实验材料及仪器
1.1材料
1.1.1细胞人脐静脉血管内皮细胞系。
1.1.2实验仪器超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；细胞培养箱（Forma）；5415D型微量台式离心机(Eppendorf,德国)；荧光定量PCR仪(上海枫岭生物技术有限公司)；垂直电泳仪和全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)。
1.1.3实验试剂RPMI-1640培养基和胎牛血清(美国Gibco)；总RNA提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司)；逆转录和qRT-PCR试剂盒(美国Thermo公司)；蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒(南京凯基有限公司)；MST1兔抗人、鼠一抗(Abcam公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养血管内皮细胞，置于37℃、50ml/LCO2培养箱中培养，当细胞密度达到70～80%左右时，分别用终浓度为100μmol/LHcy及100μmol/LHcy+叶酸+维生素B12干预，48h后收集细胞，用于后续实验。
1.2.2实时定量PCR法检测MST1mRNA水平按照RNA提取说明书提取组织及细胞RNA，按逆转录说明书逆转录合成cDNA，采用Primer5.0软件设计引物，MST1：5'-GGGTCCCAGTAGCCAAGAT-3'(上游)和5'-GAGGCACCACATACCATTCA-3'(下游)，β-actin：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'(上游)和5'-CTGGAAGGTGGACAGCGACG-3'(下游)，PCR条件：94℃预变10min，94℃变性30s、59℃退20s、72℃延长30s，扩增45个循环，反应结束后，根据扩增曲线及溶解曲线，选择符合要求qRT-PCR数据，结果用2-△△Ct法分析。
1.2.3Westernblot法检测MST1的蛋白表达改变细胞裂解法提取组织及细胞总蛋白，取各组总蛋白10μL上样后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，MST1用20V恒压转膜30min，以β-actin为内参，15V恒压转膜10min，经5%脱脂奶粉封闭2h，与MST1特异性一抗4℃孵育过夜，与二抗室温孵育2h，加入显色液,凝胶成像分析仪上分析MST1与β-actin的灰度值，并根据二者的比值，进行分析。
1.2.4MTT法检测血管内皮细胞活性将细胞悬液配成合适浓度，每100微升，铺板，使待测细胞密度1000～10000/孔，于5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔板），约8～9h，使细胞贴壁即可，不要增殖。每孔加20微升MTT溶液（5mg/ml=0.5%）培养4h（避光），终止培养，小心地吸去孔内培养液，每孔加100微升DMSO（避光），置摇床低速震荡10min，使结晶充分溶解，在酶标检测仪570nm处测OD值。
1.2.5统计学处理采用Prism5.0统计软件对实验数据进行分析整理，计量资料以mean±SD表示，两组间比较采用t检验，多组间两两比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.结果
2.1Hcy对血管内皮细胞MST1mRNA表达的影响
100μmol/LHcy作用下内皮细胞MST1的mRNA表达较对照组0μmol/LHcy作用下的表达有明显增高（P＜0.01），给予叶酸和维生素B12干预后，内皮细胞MST1的mRNA表达降低（P＜0.01）（图1）。
图1血管内皮细胞MST1mRNA表达水平改变。0μmol/L代表正常对照组，100μmol/L代表高同型半胱氨酸组，100μmol/LHcy+叶酸+维生素B12代表干预组。**P＜0.01，同型半胱氨酸组vs正常对照组；##P＜0.01，干预组vs同型半胱氨酸组。
2.2Hcy对血管内皮细胞MST1蛋白表达的影响
与正常对照组相比，高同型半胱氨酸组内皮细胞MST1蛋白的表达明显增高（P＜0.01）,与同型半胱氨酸组相比，给予叶酸和维生素B12干预后，内皮细胞MST1相关蛋白的表达降低（P＜0.01）（图2）。
图3血管内皮细胞活性的变化。0μmol/L代表正常对照组，100μmol/L代表高同型半胱氨酸组，100μmol/LHcy+叶酸+维生素B12代表干预组。**P＜0.01，同型半胱氨酸组vs正常对照组；##P＜0.01，干预组vs同型半胱氨酸组。
3.讨论
Hcy是一种含硫氨基酸，当Hcy代谢受阻，就会在体内积聚，使其在血中的水平持续升高发生HHcy[8]。HHcy已被证实是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发生的独立危险因素。而动脉粥样硬化是许多心脑血管疾病的重要危险因素，但是其发病机制尚未明确。血管内皮细胞（VECs）是单层扁平上皮，覆盖在整个心血管系统的内表面，血管内皮细胞除屏障作用外，还能产生和分泌生物活性物质，调节血管壁张力、发挥着抗凝促纤溶、参与炎症反应及血管重构等多种生物学效应[9]，VEC功能紊乱在动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发生发展中具有重要作用。近些年研究发现HHcy可导致内皮功能障碍，但具体机制不详。
MST1是体内普遍表达的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其结构类似于酵母sterile20蛋白。MST1介导了一条保守的信号通路，它可能控制着细胞的增殖与凋亡[10-12]，而Hcy致As的首发因素就是血管EC的损伤，有研究表明，高浓度的Hcy可损伤血管EC，使EC的结构和功能发生一系列的变化，从而导致As的发生，HHcy导致EC损伤的一个重要机制就是抑制EC的增殖，促进其凋亡而导致的，有研究发现TNF-α能诱导内皮细胞MST1活化，并伴随内皮细胞凋亡增多，而MST1基因敲除能明显减少TNF-α诱导的内皮细胞凋亡，进一步表明MST1活化参与了内皮细胞凋亡的调控过程，可见MST1是调控细胞损伤的重要基因。
本研究表明，在HHcy作用下，内皮细胞MST1的mRNA及蛋白表达表达均明显增加，且血管内皮细胞的活性降低，当叶酸和维生素B12干预下内皮细胞MST1的mRNA及蛋白表达都明显降低，且血管内皮细胞的活性较Hcy组有所恢复，说明Hcy能够引起MST1表达降低，且主要是通过其对细胞凋亡的调控而实现的，叶酸和维生素B12干预下能够改善HHcy所引起的MST1表达降低，但其具体的调控途径还待进一步的研究，为As的预防和治疗提供方法和思路。
【参考文献】
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