湖北省应城市中医医院检验科432400
摘要：ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏，强特异的优点。因此，应建立实验项目的标准操作程序（SOP）。
关键词：ELISA；实验；影响因素；问题分析
1971年Engvall等人把免疫组化的EIA技术应用于临床检验发展为ELISA技术。其特点为灵敏度和特异性相对较高，现广泛应用于乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等的检测，现就我多年的实验经验，浅谈整个ELISA实验过程中的影响因素及问题分析。
实验前检验人员需知
首先检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：
1、检验项目的基本原理（ELISA原理）及临床意义
2、熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；
3、熟悉检测试剂性能（包括试剂的灵敏度，特异性，精密度，稳定性，安全性等）；
4、熟悉检测仪器的原理及性能；为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。酶标仪应经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
5、某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。
标本的采集和保存
1、可用作ELISA的标本十分广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成份，一般使用血清。
2、标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，可造成假阳性；长菌的标本同样的道理易产生假阳性。
3、抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂的抗凝血。。
4、标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深。一般血清置4℃冰箱应5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存，血清融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。
5、ELISA的灵敏度应>1ng/ml水平上，标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本，最起码应先做免疫后做生化。
实验过程中易出现的问题及分析
1、漏加阳性对照；阳性对照孔忘加酶或忘加显色剂；阳性对照受污染均可引起阳性对照不显色.
2、试剂保存不当或活性下降；在使用前试剂盒未放置在室温平衡温育或时间不够或孵育温度过低，洗板浸泡时间过长、洗板次数过多；使用不正确的洗液；洗液中含有防腐剂同时残留量过多；洗板后酶标板被干透；读数时使用波长不正确；滤光片不清洁或滤光片位置错误；读数时酶标板放置位置错误；阳性对照活性下降；酶标失活均可引起阳性对照显色浅（HBeAbHBcAb阴性对照显色浅）.
3、加入标本后未进行必要的混匀；标本稀释错误；加样量不正确；冷冻标本未完全溶解混匀；标本中含有防腐剂均可引起阳性对照读数不正常.
4、实验器具被污染；血清中出现纤维蛋白凝集；血清标本中出现过多的红细胞；
血浆标本处理不当；标本中含有灰尘、颗粒或细菌等；标本被反复冻融；加标本后进行不正确的振荡；沿孔壁上加入标本，加样后出现过多的气泡；酶标滴加在孔壁上，洗板未洗净；混用洗液或洗液稀释错误；洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌；洗板次数不足或浸泡时间短；洗板时洗液量少或残留量多；洗板时洗液量过多、串孔；读数时酶标板底部有水蒸气凝结；洗液瓶、废液瓶混用；读数过程中板孔中有气泡；酶标仪偏差均可引起假阳性结果。
5、实验过程受污染；阴性对照污染；酶滴在孔壁上均可引起阴性对照显色（HBeAb、HBcAB除外）.
6、试剂和保存不当、已经失活；忘记加酶、可检查滴瓶内酶量；忘记加抗原或中和试剂；忘记加显色剂A或显色剂B均可引起整板不显色。
7、试剂盒灵敏度高；加样时使用同一枪头、交叉污染；孵育时间过长或温度过高；洗板次数不足，浸泡时间短；洗板时洗液量少或残留量多；洗板时洗液量过多、串孔；洗板机管道中有霉菌生长；洗液瓶混用；洗板机洗板头阻塞或洗板机洗板头位置错误；配置洗液的去离子水或蒸馏水被污染；终止液浓度不够，没有充分混匀，或终止液被污染；读数时酶标板底部有水蒸气凝结；酶标仪偏差均可引起血清本底高。
8、标本混匀不充分；试剂混匀不充分；标本与酶结合物混匀不充分；加样技术差异；加样器故障或加样器被污染；加样时间过长导致孵育时间不同；孵育器内部的温度不一致，造成酶标板孔间的孵育温度差异；读数时酶标板孔间有气泡均可引起同一板内重复性差。
参考文献：
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