杨树转录因子MYB93负调控类黄酮和木质素合成的分子机制研究

论文摘要

苯丙烷类化合物（如花青素、单宁、黄酮醇和木质素等）是杨树体内一类重要的次生代谢产物,其不仅广泛参与杨树抗虫、抗病、抵御紫外辐射和抗衰老等生理过程,还是杨树木材的重要组分之一。因此,解析杨树类黄酮和木质素的生物合成机制具有重大的科学意义和产业前景。本论文从杨树中筛选到了一个可同时影响类黄酮和木质素生物合成的R2R3-MYB转录因子MYB93,利用细胞生物学、分子遗传学和生物化学等实验手段,解析了MYB93对类黄酮和木质素合成的转录调控机制。本论文主要研究结果如下:（1）MYB93是一个在叶片、茎干中高水平表达,定位于细胞核的转录抑制子qRT-PCR分析显示,在野生型毛白杨中,MYB93在叶片茎干中大量表达。将MYB93启动子连接GUS报告基因的载体转入毛白杨,GUS染色分析显示其在老叶和茎中染色程度最深,与qRT-PCR结果一致。亚细胞定位证明了MYB93定位于细胞核中;酵母自激活实验证明MYB93具有转录抑制功能。（2）PtoMYB93抑制了花青素、单宁以及木质素的生物合成为阐明MYB93转录因子的生物学功能,构建其超量表达和CRISPR/Cas9基因敲除的表达载体,转化至野生型毛白杨。表型观察和组织化学染色分析显示,在超量表达MYB93的转基因杨树叶片中,花青素和单宁的含量显著降低;而在敲除MYB93的杨树中,花青素和单宁的含量均有所提高。同时,与野生型毛白杨相比,MYB93超量表达转基因的植株高度变矮,茎秆直径变细,茎部木质部细胞层数变少,木质素自发荧光变弱,木质素含量降低;敲除株系虽然呈现相反趋势,但无显著差异。qRT-PCR分析显示,在MYB93超量表达的转基因杨树中,花青素、单宁及木质素合成途径中关键酶的表达水平明显下调,在MYB93敲除的毛白杨中,它们的表达水平均上调,说明MYB93对花青素、单宁以及木质素生物合成的影响可能是通过调节关键酶基因的表达来完成。（3）MYB93通过调控下游酶基因的启动子,利用EAR结构域抑制关键酶基因的表达通过Effector-Reporter实验,将MYB93超量表达载体与关键酶基因的启动子载体共同转化烟草,证明MYB93可调控花青素、单宁以及木质素合成的关键酶基因的启动子,抑制其表达,从而抑制花青素、单宁及木质素的生物合成。前人研究表明,在MYB转录抑制子中存在EAR结构域,其在花青素和单宁合成中发挥重要作用。将突变掉EAR（LxLxL）结构域的突变体△MYB93,与关键酶基因启动子进行瞬时表达分析显示,突变掉EAR结构域后,△MYB93对下游酶基因启动子的抑制调控功能缺失。暗示MYB93对花青素、单宁及木质素合成的抑制作用可能是通过EAR结构域完成的。（4）MYB93与TT8、TTG1形成MBW复合体,可以增强MYB93对花青素和单宁生物合成的抑制功能研究表明,在类黄酮生物合成中,MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白可以形成MBW复合体,增强MYB转录因子对下游基因的激活或抑制功能。在烟草叶片中瞬时表达分析显示,当加入TT8、TTG1时,MYB93对类黄酮途径中关键酶基因的抑制作用增强。酵母双杂交的实验证明MYB93与TT8存在直接相互作用,TT8作为桥梁使其与MYB93、TTG1形成MBW复合体来负调控类黄酮途径的生物合成。（5）MYB93和MYB57转录调控功能差异的分子机制分析MYB93和MYB57均为拟南芥AtMYB4的同源基因,但MYB93可同时抑制花青素、单宁及木质素的生物合成,而MYB57仅能抑制花青素和单宁的合成,二者在调控功能上存在明显差异。组织表达特异性分析显示,MYB93在叶片、木质部和韧皮部等组织均具有较高的表达水平,而MYB57仅在叶片具有较高表达水平,在木质部和韧皮部表达水平极低,暗示其不参与木质素的合成调控。qRT-PCR和瞬时表达分析显示,MYB57不能结合到木质素合成关键酶基因的启动子上,调控其表达。综上所述,本研究初步证明,MYB93作为转录抑制因子,其通过与TT8、TTG1形成MBW复合体,抑制类黄酮合成途径关键酶基因的表达活性,从而负调控花青素和单宁的生物合成。同时,MYB93也可通过下调木质素合成途径关键酶基因的表达,抑制木质素的生物合成。本论文研究结果为解析杨树中苯丙烷代谢的分子遗传机制提供了新的证据,也为林木育种和木材优化奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 杨树的研究背景及现状
•     1.1.1 杨树的生物学特征及用途
•     1.1.2 杨树的研究现状
•   1.2 植物的防御机制
•   1.3 苯丙烷类化合物的研究概况
•     1.3.1 苯丙烷类化合物生物的分类及功能
•     1.3.2 类黄酮的生物合成及功能
•     1.3.3 木质素的生物合成及功能
•     1.3.4 影响苯丙烷类化合物生物合成的因素
•     1.3.5 苯丙烷类化合物的研究进展
•   1.4 MYB转录因子
•     1.4.1 MYB转录因子的种类、结构和保守性
•     1.4.2 MYB转录因子对类黄酮代谢途径的调控
•     1.4.3 MYB转录因子对木质素代谢途径的调控
• 第2章 引言
•   2.1 研究目的与意义
•   2.2 研究内容
•     2.2.1 转录因子MYB93的功能预测
•     2.2.2 杨树MYB93基因及启动子的扩增
•     2.2.3 杨树MYB93基因组织表达特异性分析
•     2.2.4 转录因子转录MYB93亚细胞定位及转录活性分析
•     2.2.5 转基因杨树的功能分析
•     2.2.6 杨树MYB93转录调控机制解析
•   2.3 研究目标
•   2.4 技术路线
• 第3章 材料与方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 菌株和质粒
•     3.1.3 购买的试剂及试剂盒
•     3.1.4 抗生素与激素的配制
•     3.1.5 植物培养基及细菌真菌培养基
•     3.1.6 质粒提取试剂（自配）
•     3.1.7 其它试剂的配制
•     3.1.8 主要仪器设备
•   3.2 方法
•     3.2.1 进化分析
•     3.2.2 引物设计
•     3.2.3 植物表达载体构建
•     3.2.4 荧光定量
•     3.2.5 酵母表达载体构建及转化
•     3.2.6 毛白杨的遗传转化
•     3.2.7 转基因杨树的鉴定
•     3.2.8 烟草细胞的遗传转化
•     3.2.9 MYB93转基因植株中花青素和单宁含量的测定
•     3.2.10 GUS酶活定量分析
•     3.2.11 启动子GUS染色
•     3.2.12 单宁的DMACA染色
•     3.2.13 木质素的甲苯胺蓝染色
•     3.2.14 木质素含量的测定
• 第4章 结果与分析
•   4.1 MYB转录因子的进化分析及同源性比对
•     4.1.1 MYB转录因子的进化分析
•     4.1.2 氨基酸序列比对
•   4.2 杨树MYB93的组织特异性分析
•   4.3 杨树MYB93的亚细胞定位和转录激活分析
•     4.3.1 MYB93为定位于细胞核的转录因子
•     4.3.2 MYB93为转录抑制子
•   4.4 转基因杨树的构建及鉴定
•   4.5 MYB93对杨树中花青素单宁生物合成的影响
•     4.5.1 转基因杨树表型观察
•     4.5.2 转基因杨树中花青素、单宁生物含量的测定
•     4.5.3 转录因子对类黄酮合成途径中关键酶基因的影响
•   4.6 MYB93对杨树中木质素生物合成的影响
•     4.6.1 转基因杨树的形态解剖学观察
•     4.6.2 转基因杨树中木质素含量的测定
•     4.6.3 转录因子对木质素合成途径中关键酶基因的影响
•   4.7 MYB93对杨树苯丙烷代谢途径中关键酶基因调控作用分析
•   4.8 MYB93对杨树苯丙烷代谢途径调控的分子机制
•   4.9 MYB93和MYB57对杨树苯丙烷代谢途径调控的差异
• 第5章 讨论
•   5.1 讨论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表论文及参加课题一览表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 窦立雯

导师: 罗克明

关键词: 苯丙烷类化合物,杨树,转录因子,结构域

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西南大学

分类号: Q943.2

总页数: 91

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