导读:本文包含了内流机制论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:离子,神经元,损伤,线粒体,流弹,脂蛋白,水轮机。
内流机制论文文献综述
李琪飞,刘萌萌,张震,张建勋,刘谦[1]（2019）在《水泵水轮机制动工况内流特性分析》一文中研究指出为研究水泵水轮机在制动工况运行时内部流动特性,在确定的等开度线上选取具有代表性的制动工况点,对其进行了全流道数值计算.选用SST k-ω湍流模型,采用SIMPLEC耦合算法,对选定工况点的机组整体流动域内的叁维复杂流态进行了分析.结果表明:机组进入制动工况后流态总体上呈现出不稳定状态,多伴有大尺度漩涡的产生.其中蜗壳及固定导叶内流动较为平稳,自活动导叶进口处出现小尺度漩涡,在转轮中流态不稳定达到极致,叶道间出现大尺度漩涡;转轮进出口流动虽以水轮机工况流动方向为主,但受转轮内大尺度旋涡及离心力影响,回流严重流动紊乱,流态转入反水泵工况的趋势明显;尾水管内流动呈现显着的螺旋态,从进口开始流动回旋紧贴壁面,直锥段出现大幅回流反向进入转轮区域.此工况机组整体流域的复杂流动势必加剧机组的振动,对其稳定运行造成极大的影响.(本文来源于《兰州理工大学学报》期刊2019年01期）
余琦,王章利,张光伟,徐仓宝[2]（2018）在《他汀类药物引起新发糖尿病风险升高的病理机制:LDLR介导胆固醇内流引起胰岛β细胞“脂毒性”》一文中研究指出高血脂是心血管病与糖尿病的共同危险因素,然而临床上使用他汀类药物控制血脂却增加了患者新发糖尿病的风险。相反,家族性高胆固醇血症(FH)病人有较高的血脂并长期使用他汀类药物,这类患者罹患糖尿病的风险却降低了。考虑到FH病人主要是由低密度脂蛋白受体(LDLR)突变引起的,这使得LDLR介导的胆固醇代谢是否参与糖尿病的发病成为疑问。他汀类药物能够上调肝脏和某些组织的LDLR表达并促进胆固醇内流,有可能引起某些胰岛细胞"脂毒性"的发生。胰岛β细胞对胆固醇较敏感,少量胆固醇蓄积就能造成细胞功能障碍。本文旨在讨论LDLR在他汀类药物诱发的糖尿病中的病理角色,为降低该药的不良反应、促进2型糖尿病的防治提供新的思考。(本文来源于《中国动脉硬化杂志》期刊2018年04期）
朱剑军[3]（2018）在《TNFα介导钙离子内流促进肝癌细胞凋亡的作用及机制研究》一文中研究指出临床前研究结果表明TNFα诱导肿瘤细胞凋亡呈剂量依赖性。然而,临床试验发现,在肿瘤治疗过程中,TNFα治疗诱发了显著的全身性毒性,并且患者对TNFα的最大耐受剂量较低,这严重阻碍了TNFα从基础研究向临床应用的转化。如何降低TNFα的毒副作用,如何在患者可忍受的剂量范围内提高TNFα的疗效,这急需我们去解决。我们的研究团队首次发现:在肝癌细胞中,TNFα能够诱导钙离子内流,并呈剂量依赖性。文献报道,细胞内钙离子(Ca~(2+))水平的变化与多种细胞活动密切相关。胞内钙离子的浓度能够决定细胞“生”与“死”。我们研究进一步发现TNFα诱导钙离子内流与细胞凋亡密切相关。基于此,我们提出本课题的科学假说:TNFα诱导钙离子内流促进细胞凋亡;通过调控肝癌细胞钙离子摄入,放大TNFα介导的细胞凋亡;联合应用TNFα和钙离子摄取药物,能够有效提高抗肿瘤药物TNFα的肿瘤杀伤效果。【目的】本课题以肝细胞癌为研究对象,明确TNFα具有诱导钙离子内流的作用,探索TNFα诱导钙离子内流促进细胞凋亡的作用及机制研究。【方法】1.利用Fura-2/AM活细胞染色,分析肝癌细胞胞浆钙离子水平的变化;2.利用Annexin-V凋亡检测、TUNEL等实验方法,检测细胞凋亡;3.利用免疫共沉淀实验,研究TNFα调控TRP通道蛋白的作用机制;4.利用裸鼠皮下荷瘤实验,检测TNFα在体内对肝癌生长及凋亡的影响;5.利用qPCR和免疫印迹等方法检测凋亡相关分子,分析TNFα介导的钙离子内流促进肝癌细胞凋亡的作用机制;6.利用TMRM染色方法,检测肝癌细胞线粒体膜电位;7.利用免疫荧光,检测细胞色素c在肝癌细胞中的定位;【结果】第一部分:我们的研究结果显示:在肝癌细胞中,TNFα刺激导致胞浆钙离子水平显著升高,并呈剂量依赖性。通过干预细胞外液钙离子浓度,发现TNFα诱导后胞浆中升高的钙离子主要来源于细胞外液,与胞内钙库无关。第二部分:siRNA靶向沉默TNFR1后发现:TNFα诱导钙离子内流与TNFR1无关。电压型钙离子通道抑制剂Diltiazem和Verapamil对TNFα介导的钙离子内流没有影响,说明TNFα介导钙离子内流与电压型钙离子通道无关。TRP通道抑制剂CAI和SKF96365处理能够显着抑制TNFα介导的钙离子内流。siRNA靶向沉默TRPM7后TNFα诱导的钙离子内流显著降低。免疫共沉淀实验结果显示TNFα与TRPM7没有直接的相互作用,暗示TNFα以间接的方式激活TRPM7通道介导胞外钙离子内流。第叁部分:通过检测细胞胞浆钙离子水平及细胞凋亡,发现降低胞浆钙离子水平能够显着抑制TNFα诱导的细胞凋亡;升高胞浆钙离子水平能够显着促进TNFα诱导的细胞凋亡。体内实验表明,过表达小清蛋白,清除胞浆钙离子,能够显着抑制TNFα的抗肿瘤活性;离子霉素联合TNFα治疗能够显著提高TNFα的肿瘤杀伤活性。第四部分:通过检测calpain活性及凋亡相关分子蛋白水平,证实:TNFα介导钙离子内流激活calpain/IAP/Caspase 3途径导致细胞凋亡。并且,通过检测线粒膜电位,细胞色素c定位和Bcl-2家族相关分子,证实:TNFα介导钙离子内流促进肝癌细胞凋亡与线粒体介导的内源性凋亡途径无关。【结论】本课题研究发现:在肝癌细胞中,TNFα通过介导胞外钙离子内流激活calpain/IAP/Caspase 3途径促进细胞凋亡,暗示改变胞浆钙离子水平可能是一种提高TNFα肿瘤杀伤活性的有效策略。(本文来源于《中国人民解放军空军军医大学》期刊2018-05-01）
王慧芳[4]（2018）在《细胞外组蛋白通过Ca~(2+)内流激活线粒体通路介导Raw264.7细胞凋亡的机制及其研究》一文中研究指出研究背景脓毒症(sepsis)是机体对感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍。它是感染、创伤、休克、烧伤以及术后常见的并发症,也是导致多器官功能障碍综合征的重要原因。据流行病学统计,美国每年大概有751000人被诊断为脓毒症,其中215000人因治疗无效死亡。脓毒症不仅病理机制复杂而且具有发病迅速、病情进展快的特点,是危重患者死亡的重要原因。在脓毒症患者中,免疫功能抑制普遍存在,多种机制参与了脓毒症患者的免疫抑制,免疫细胞凋亡在其中发挥了重要的作用。巨噬细胞是重要的固有免疫组成细胞,同时也是重要的抗原提呈细胞,在协调固有免疫和获得性免疫中发挥了重要作用。研究显示在脓毒症的发生发展过程中除T细胞大量凋亡外,巨噬细胞也出现大量凋亡。动物实验中同样观察到在脓毒症早期阶段即出现巨噬细胞的大量凋亡。此外,脓毒症时大量炎症介质释放并激活相关的信号通路加剧炎症反应并导致细胞凋亡,其中早期细胞因子TNF-α和晚期细胞因子高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)均参与了细胞凋亡。姚咏明课题组发现HMGB1可使Caspase-3活性明显增高,并可导致巨噬细胞凋亡。目前学术界己经明确指出固有免疫系统中的巨噬细胞在启动以及维持机体免疫反应方面发挥重要作用,免疫细胞的大量凋亡进一步加重了机体免疫系统紊乱,诱发脓毒症休克以及多器官功能障碍综合征。组蛋白(histone)是染色体的重要组成部分,正常生理状态下循环中组蛋白含量极少很难被检测到,而在临床工作中却在脓毒症患者中检测到大量组蛋白。细胞外大量的组蛋白不仅可以诱导炎症因子释放、发挥细胞毒性作用,而且可以损伤线粒体造成细胞功能障碍、胞内钙超载,进而诱发细胞凋亡。大量免疫细胞凋亡后机体进入免疫抑制/免疫麻痹状态,免疫系统的崩溃导致机体难以对抗残存病原体,诱发二重感染或脓毒症休克以及多器官功能障碍,最终导致患者死亡。因此,细胞外组蛋白在脓毒症的发生发展中占有重要地位,被认为是导致脓毒症患者死亡的关键物质。细胞凋亡是一种由基因调控的程序性死亡。在细胞凋亡过程中调控凋亡的促凋亡基因与抑凋亡基因相互影响,并通过外源性凋亡信号通路、细胞内线粒体通路以及内质网信号通路介导细胞凋亡。细胞内Ca2+超载、线粒体损伤、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase蛋白酶)以及活性氧(ROS)等也参与细胞凋亡过程。钙离子作为机体常见的信号因子,参与不同阶段的细胞凋亡过程。因此,钙离子是另一种重要的诱导细胞凋亡的物质。目前已明确在脓毒症发生发展过程中存在巨噬细胞大量凋亡,但是细胞外组蛋白是否介导了巨噬细胞凋亡以及其具体凋亡机制尚不清楚。依据既往文献报道,我们推测脓毒症时细胞外组蛋白可能通过Ca2+内流后损伤线粒体,激活线粒体通路导致巨噬细胞凋亡。本实验通过使用小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞深入探究细胞外组蛋白对巨噬细胞凋亡的作用及其机制,明确细胞外组蛋白与细胞Ca2+内流、线粒体损伤、细胞凋亡之间关系。研究目的1、明确组蛋白是否可以引起Ca2+内流;2、探讨组蛋白是否通过Ca2+内流损伤线粒体;3、探讨组蛋白是否通过线粒体损伤介导Raw264.7细胞凋亡;4、明确组蛋白诱导Raw264.7细胞凋亡的信号通路。研究方法1、采用Fluo3-AM荧光染色法染色Raw264.7细胞并结合流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度;2、采用Rhodamin123染色法染色Raw264.7细胞并结合流式细胞仪检测其线粒体膜电位变化;3、采用Annexin V FITC/PI双染法染色Raw264.7细胞并结合流式细胞仪检测组蛋白对细胞凋亡的影响;4、通过 Western Blot 检测 Bc1-2、胞浆细胞色素 C(Cytochrome C,Cyt-C)以及Cleaved Caspase-3 的表达;数据分析方法所有实验结果使用SPSS 19.0进行统计学分析,结果以均数±标准差(X±S)表示。应用2-tailed unpaired t检验比较各组间之间的差异;P值小于0.05表示结果存在统计学差异。研究结果1、组蛋白可以诱导Raw264.7细胞Ca2+内流,并且这种作用具有时间依赖性和浓度依赖性特征;MgSO4可以抑制组蛋白诱导Raw264.7细胞的Ca2+内流。2、组蛋白通过促进Ca2+内流介导巨噬细胞的线粒体损伤。3、组蛋白通过促进Ca2+内流诱导Raw264.7细胞凋亡。4、组蛋白通过线粒体损伤介导巨噬细胞凋亡。研究结论细胞外组蛋白通过Ca2+内流造成线粒体损伤,致使线粒体膜通透性改变,Cyt-C释放至胞浆内,并介导Caspase-3活化,最终引起Raw264.7细胞的凋亡。(本文来源于《南方医科大学》期刊2018-05-01）
饶维[5]（2017）在《容量性钙内流在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制研究》一文中研究指出【研究背景】缺血性脑卒中(Cerebral ischemia stroke),是神经系统最为常见的急重症之一,是指各种脑血管先天发育异常以及后天因素(高血压、高脂血症、糖尿病等)引起的脑血管管腔狭窄、闭塞或堵塞,从而导致局部或全脑脑血流灌注锐减或中断而引发的一种疾病。缺血性脑卒中其发病率、致残率及致死率均高,严重威胁我国人民健康及生活质量。随着医学的发展,缺血再灌注治疗(包括急性溶栓、介入取栓或支架置入及血管搭桥等)在临床得到广泛应用,也取得较好的疗效。然而,在获得缺血再灌注治疗益处的同时,其也可引起明显的脑缺血再灌注损伤,严重影响治疗效果。研究发现,多种致伤机制均参与其中,如钙超载、兴奋性毒性、氧化应激及内质网应激等。已有大量研究旨在阐明脑缺血再灌注损伤的致伤机制及寻找其潜在的干预靶点,然而,目前情形并不容乐观。容量性钙内流(Capacity calcium entry,CCE)是细胞内钙动态平衡的重要调节机制,通过感应内质网内钙浓度,调控CCE复合体形成,介导外钙内流,补充细胞内及钙库内钙。CCE复合体主要由钙浓度感应分子——基质相互作用分子(Stromal interaction molecule,STIM)、钙释放激活的钙通道(Ca~(2+)release-activated Ca~(2+)channels,CRACs)及相关调节蛋白构成。氧化应激、钙库排空及细胞酸化等因素可激活CCE,形成CCE复合体,调控神经元存活,参与急、慢性神经系统疾病的发生与发展。如前所述,氧化应激、钙超载等均参与脑缺血再灌注损伤,那么CCE是否在其中发挥作用,及其具体机制如何,目前尚不可知。【研究目的】本研究旨在:(1)明确脑缺血再灌注损伤中,CCE主要构成分子时空变化规律及其作用;(2)探讨调控CCE所介导的神经保护机制;(3)寻找潜在的CCE内源性调控分子,为脑缺血再灌注损伤治疗提供新的思路或潜在的干预靶点。【研究方法】1、采用原代海马神经元氧糖剥夺再灌注(Oxygen-glucose deprivation&reperfusion,OGD/Rep.)模型体外模拟脑缺血再灌注损伤;采用谷氨酸诱导的HT-22细胞系氧化应激模型研究Homer1a与CCE间相互作用关系;2、采用实时定量PCR技术及蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测OGD/Rep.处理后CCE构成分子、凋亡及自噬相关分子的mRNA及蛋白水平改变;3、采用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放量检测评价神经元损伤情况,采用原位末端标记(Terminal dUTP nick end labelling,TUNEL)方法检测神经元凋亡改变;4、采用转染STIM1、STIM2及内质网等荧光蛋白标记质粒及免疫荧光染色技术可视化CCE构成分子空间定位变化;5、采用慢病毒介导的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)及CRISPR/Cas9技术调控神经元STIM1、STIM2及Homer1a表达水平;6、采用转染LC3-GFP及mRFP-GFP-LC3荧光蛋白标记质粒可视化神经元自噬及自噬流改变;7、采用CCE、钙调素依赖的蛋白激酶II(Calmodulin-Dependent Protein Kinase II,CaMKII)及自噬药物抑制剂或激动剂调控其活性;8、采用Fluo-4 AM、Fura-red AM及胞浆钙荧光指示蛋白监测CCE介导的钙内流及胞浆内钙水平改变;9、采用蛋白质免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,co-IP)技术检测蛋白分子间相互作用。【研究结果】第一部分研究发现:OGD/Rep.处理后,CCE主要构成分子,包括STIM1、STIM2、Orai1、Orai2及TRPC1 mRNA及蛋白水平均无明显改变,然而,胞浆内STIM1斑块数明显增加;抑制CCE可明显减轻OGD/Rep.引起的神经元细胞内钙超载;下调或敲除STIM1表达或应用CCE药物抑制剂均可明显减轻OGD/Rep.诱导的神经元损伤,抑制其凋亡,促进神经元存活。本部分研究表明,CCE参与OGD/Rep.介导的神经元损伤的致伤机制,抑制CCE可发挥神经保护作用。第二部分研究发现:OGD/Rep.处理后,神经元自噬水平增加,但同时也存在一定程度的自噬降解受阻;药物激动剂激活自噬可减轻OGD/Rep.介导的神经元损伤;CCE抑制可发挥类似自噬激动剂的作用,在激活神经元自噬的同时,并一定程度改善自噬降解受阻;进一步研究发现,OGD/Rep.处理后,CaMKII磷酸化水平明显增加,而抑制CaMKII活性可明显下调雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)磷酸化水平,促进自噬激活,减轻神经元损伤;抑制CCE后,CaMKII及mTOR磷酸化水平均明显下降,且CCE抑制及mTOR抑制所介导的神经保护作用并无明显迭加效应。本部分研究表明,抑制CCE可一方面通过抑制CaMKII-mTOR信号,促进自噬形成,同时另一方面也可改善自噬降解受阻,发挥神经保护作用。第叁部分研究旨在寻找CCE潜在的内源性负性调控分子,为排除离子型谷氨酸受体的影响,特采用谷氨酸诱导的HT-22细胞系氧化应激模型,研究发现:氧化应激损伤后,STIM1及Orai1蛋白水平无明显改变,而STIM1胞浆内斑块数明显增加,并逐渐向细胞膜靠近;下调或敲除STIM1表达或采用CCE药物抑制剂均可减轻神经元氧化应激损伤;上调Homer1a表达则可明显抑制CCE所介导的钙内流、氧化应激所引起的晚期细胞内钙超载及线粒体氧化应激损伤,发挥类似CCE抑制所介导的神经保护作用;此外,co-IP发现STIM1、Homer1a及Orai1间存在明显蛋白相互作用,上调Homer1a蛋白表达可明显抑制谷氨酸引起的STIM1-Orai1复合体形成。以上实验结果表明,抑制CCE可减轻神经元氧化应激损伤,而Homer1a可通过抑制STIM1-Orai1复合体形成负性调控CCE,发挥神经保护作用。【研究结论】本研究首先证实,CCE参与脑缺血再灌注损伤的致伤机制,抑制CCE可发挥神经保护作用;该神经保护作用其机制可能与促进自噬发生、改善自噬降解障碍及抑制凋亡有关;此外,本研究还发现一种CCE内源性负性调控分子——Homer1a,其可通过负性竞争抑制STIM1-Orai1复合体形成,抑制CCE,介导神经保护作用。以上研究进一步揭示了脑缺血再灌注损伤的致伤机制,也发现了该致伤机制的内源性调控分子,为缺血性脑卒中的治疗提供了新的切入点及干预靶点。(本文来源于《第四军医大学》期刊2017-05-01）
赵真[6]（2017）在《低频振动对人脐静脉血管内皮细胞钙内流和自噬流的影响及分子机制》一文中研究指出前庭功能障碍严重影响患者的工作和生活质量,尤其是眩晕。前庭功能紊乱或障碍带来的周围型眩晕有着较高的发病率,如常见的梅尼埃病,除了前庭症状外,该病还伴有耳闷、耳鸣以及听力下降等耳蜗症状。药物治疗、手法操作、手术治疗以及各种前庭康复广为开展。低频振动作为新颖的治疗手段在门诊治疗中,改善了患者的总体感觉,控制了眩晕,减轻耳鸣和耳闷症状,并增加了患者的头部舒适感。本研究观察了低频振动对单侧前庭功能低下患者眩晕恢复的促进作用,经乳突投放低频振动,明显促进了眩晕的康复过程。为了进一部探寻低频振动在治疗眩晕症状上的作用机制,从细胞学和分子生物学上探索低频振动是如何达到控制并改变内耳前庭细胞的功能。本实验课题利用公认研究脉管系统的模型细胞,即人脐静脉血内皮细胞(HUVEC),建立其转染mRFP-GFP-LC3腺病毒和线粒体毒素干扰自噬的实验模型。观察低频振动对HUVEC细胞钙内流和自噬流的影响,并与氟桂利嗪阳性对照组比较。采用磷酸化广谱筛选抗体芯片,分析低频振动对线粒体损伤的HUVEC细胞的信号通路蛋白磷酸化水平的影响,进而探索低频振动对人脐静脉血管内皮细胞影响的分子机制。第一部分低频振动剪切应激治疗单侧前庭功能低下的疗效分析目的探讨低频振动在单侧前庭功能低下患者眩晕康复中的作用。方法共收集我院门诊的诊断为单侧前庭功能低下患者25人,均为前庭神经元炎后遗症,分为低频振动治疗组和常规前庭康复治疗组。低频振动治疗组采用经患侧乳突进行100Hz低频振动,每次30分钟,每周2次,连续治疗2周。前庭康复治疗组患者在康复科康复治疗师指导下采用TECNOBODY平衡测试及训练系统进行感觉整合训练、前庭功能训练、重心控制训练。两组患者分别于治疗前、治疗后进行DHI评分及VVAS评分。所有计数资料采用均数±标准差方式记录,采用SPSS软件进行方差分析。计量资料采用卡方检验进行统计分析,取p<0.05为有统计学意义。结果按照DHI总分改善18分以上为有效,低频振动治疗组总有效率为76.9%(10/13),前庭康复组为83.3%(10/12),经卡方检验两组差异无统计学意义。结论经乳突低频振动与传统的前庭康复锻炼对眩晕症状的改善效率相当,对患者无其他不良影响。相对于前庭康复锻炼需要专业的康复师和专业的场地而言,低频振动治疗前庭功能障碍操作简便,对场地无特殊要求,技术员培训难度低。本研究结果显示,低频振动治疗前庭功能低下的短期效果明显,长期效果还需要增加样本量及进一步延长随访时间。第二部分低频振动对人脐静脉血管内皮细胞钙内流的影响目的了解低频振动在调节人脐血内皮细胞钙内流方面的作用。方法利用人脐血内皮细胞(HUEVC)作为模型细胞,用FLUO-3钙离子示踪剂显示细胞内钙离子的实时变化,用3-NP处理建立细胞损伤的模型,用低频振动对其进行治疗干预,用氟桂利嗪作为阳性对照。通过荧光显微镜结合图像分析和半定量测试,实时观察3-NP诱导钙内流的变化以及低频振动干预治疗后,细胞钙内流发生的改变。结果与正常细胞相比,3NP处理后的HUEVC细胞,绿色荧光强度明显加强,出现钙超载现象。3NP处理后的HUEVC细胞,分别施加低频振动,或者加入氟桂利嗪,在3NP+低频振动组和3NP+氟桂利嗪组,分别在1分钟,5分钟,15分钟,20分钟,30分钟,与3-NP处理后的HUVEC细胞,即造模细胞相比,在不同时间点的比较上,绿色荧光强度明显降低,钙超载水平逐步降低。通过半定量荧光值的统计分析,具有明显的统计学差异。结论低频振动可以明显降低了因受线粒体损伤而增强的钙内流。第叁部分低频振动对人脐静脉血管内皮细胞自噬流的影响目的了解低频振动在调节内耳血管功能方面的可能自噬因素。方法利用人脐血内皮细胞(HUEVC)作为模型细胞,用mRFP-GFP-LC3腺病毒转染使其表达荧光标记自噬标志性的微管相关蛋白1轻链3,用3-NP处理建立细胞损伤的模型,用低频振动对其进行治疗干预,用氟桂利嗪作为阳性对照。通学过激光共聚焦显微镜,从形态学上,实时观察3-NP诱导自噬流的变化。用全自动流式细胞仪,定量观测经转染mRFP-GFP-LC3腺病毒后的HUVEC细胞自噬流的变化。结果与正常细胞相比,3NP处理减少了自噬小体(绿色)的数量,更多地与溶酶体融合(黄和红色)。在经3NP处理后,分组分别加入氟桂利嗪,或者低频振动,在3NP低频振动和氟桂利嗪均明显提高了HUVEC细胞的自噬率。定量荧光值的统计分析,具有明显的统计学差异。结论低频振动可以明显提高了因受因为线粒体损伤而降低的自噬水平。低频振动有可能通过影响细胞的自噬,而抑制过渡的炎症反应,从而缓解内耳损伤的病理过程。第四部分低频振动对人脐静脉血管内皮细胞影响的分子机制目的探索低频振动对线粒体损伤后HUVEC细胞的信号通路蛋白磷酸化水平的影响,进而研究低频振动干预线粒体损伤的人脐静脉血管内皮细胞病理过程的分子机制。方法采用信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片(PEX100),利用叁维高分子膜专利技术,在片基上高密度结合1318种高特异抗体。对HUVEC细胞的全细胞蛋白进行检测。共分为四组,空白对照组,3-NP造模组,3-NP+氟桂利嗪组以及3-NP+低频振动组。以氟桂利嗪,钙离子阻滞剂作为阳性对照。对4组细胞分别进行检测432个信号蛋白的679个磷酸化位点。对检测出的通道进行数据分析,公式计算,组间比较,进行统计学数据分析。结果与3-NP造模组未受干预的细胞相比,低频振动组增加其磷酸化水平6倍以上的主要信号通路蛋白有:NMDAR2B(Phospho-Tyr1472),MEK1(Phospho-Ser298),Lamin A/C(Phospho-Ser392),HDAC1(Phospho-Ser421),PECAM-1(Phospho-Tyr713),P90RSK(Phospho-Thr359/Ser363),P90RSK(Phospho-Thr573),LAT(Phospho-Tyr171),PP2A-alpha(Phospho-Tyr307),Merlin(Phospho-Ser10),MKK4/SEK1(Phospho-Ser80),BLNK(Phospho-Tyr96),14-3-3 zeta/delta(Phospho-Thr232)。与3-NP造模组未受干预的细胞相比,低频振动组增加其磷酸化水平6倍以上的主要信号通路蛋白有:NMDAR2B(Phospho-Tyr1472),MEK1(Phospho-Ser298),Lamin A/C(Phospho-Ser392),HDAC1(Phospho-Ser421),PECAM-1(Phospho-Tyr713),P90RSK(Phospho-Thr359/Ser363),P90RSK(Phospho-Thr573),LAT(Phospho-Tyr171),PP2A-alpha(Phospho-Tyr307),Merlin(Phospho-Ser10),MKK4/SEK1(Phospho-Ser80),BLNK(Phospho-Tyr96),14-3-3 zeta/delta(Phospho-Thr232)。结论从诸多筛选出的信号通路中,我们可以分析出:对于HUVEC细胞,用3-NP干扰其自噬,用低频振动进行干预治疗,以氟桂利嗪作为阳性对照,增加磷酸化水平6倍以上的主要信号通路中,低频振动增强信号通路控制点下游分子磷酸化水平上,有明显的促进细胞生长,增强自噬,抑制凋亡的作用。(本文来源于《第二军医大学》期刊2017-05-01）
李子源[7]（2017）在《弹性导热仿生功能表面内流减阻性能与机制实验研究》一文中研究指出弹性导热仿生功能表面是一种兼具良好弹性和导热性的复合材料表面,其设计目的是为了解决模仿海豚皮肤的弹性表面在流体压力作用下的变形生热不能及时传导到外界,发生老化使其性能下降的问题,并提高其减阻性能。本文对以具有高导热率的石墨烯为填料,硅橡胶为基料复合而成弹性导热仿生功能表面的材料属性进行了测试分析,并针对弹性导热仿生功能表面作为内流流场壁面工况下的减阻性能和机制进行了研究。弹性导热仿生功能表面与流体间的作用是流-固-热多种物理场相互耦合的复杂关系。依照GB7757、GB528、GB12830等标准,本文对具有不同石墨烯含量的弹性导热仿生功能表面的压缩性能、拉伸性能和剪切性能进行了研究。结果表明,它们弹性模量基本一致,并呈现出高度非线性。通过橡胶电子拉力试验机获得了它们在压缩模式下的滞回曲线,对应变为0.25时的热损耗进行了定量计算,求得了损耗因子,并用动态热机械分析仪对结果进行的验证测试,结果表明石墨烯的含量对弹性导热仿生表面的动态生热能力几乎没有影响。采用热流法导热仪对其导热系数进行了测试,结果表明,石墨烯的填充能够显着提高硅橡胶的导热系数,石墨烯填充量越大,弹性导热仿生功能表面的导热率越大。针对弹性导热仿生功能表面的特点,设计了基于压差测试原理的仿生功能表面内流测试系统。并在测试系统上对具有不同石墨烯含量和厚度的弹性导热仿生功能表面和弹性表面的减阻性能进行了测试。结果表明,流速(雷诺数)对减阻性能有着显着影响,流速越大,减阻性能越好。在相同流速下,石墨烯含量越高,导热系数越大,减租率越高。石墨烯填充量为1.34wt%的弹性导热仿生功能表面在流速为1.5m/s时达到了最大减阻率8.54%,比在相同同流速下弹性表面的减阻率高1.17%。此外,试样的厚度也会对减阻性能产生一定的影响。弹性导热仿生功能表面的减阻主要依靠弹性变形和良好的导热性能来实现。弹性变形能够降低流体边界层的速度梯度,良好的导热性能将弹性变形产生的内热快速传递到流体,使流体边界层温度升高,动力粘度降低,两种因素联合作用实现了减阻功能。可以预见,弹性导热仿生功能表面由于其良好的减阻特性、快速导热性能,从而不易积聚内热,抗老化性能较强,具有良好的工程应用价值。(本文来源于《吉林大学》期刊2017-05-01）
徐振宽[8]（2016）在《钙池调控的钙离子内流在高血糖诱导的神经元损伤中的作用机制研究》一文中研究指出糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由遗传和环境因素共同导致的以慢性高血糖为主要特征的临床综合征。糖尿病可引起多种慢性并发症,导致肾、视网膜等多器官功能障碍或衰竭,严重者可致残或致死。有关糖尿病引起的神经系统并发症的研究多集中在周围神经系统,主要是糖尿病引起的周围神经病变。近年来的研究表明糖尿病同样引起中枢神经系统并发症,主要表现为糖尿病认知功能障碍(diabetic cognitive dysfunction)。海马是边缘系统的一部分,主要与学习和记忆功能有关。糖尿病认知功能障碍与高血糖导致的海马组织损伤密切相关。但是高血糖导致的海马神经元损伤的分子机制复杂,至今尚未完全明确。因此,探索高血糖导致的海马神经元损伤的具体机制对于预防糖尿病所致的认知功能障碍和提升糖尿病患者的生存质量具有重大的意义。钙离子(calcium ion, Ca2+)是细胞内常见的第二信使之一,它参与了诸如增殖、转录、胞吐、凋亡等细胞生理或病理过程。钙离子内流的主要通道包括电压调控钙离子通道、受体激活钙离子通道和钙池调控的钙离子通道。其中钙池调控的钙离子通道(store-operated calcium channels, SOCs)是包括神经元在内的多种细胞中钙离子内流的主要通道之一,它主要由基质相互作用分子(stromal interaction molecule, STIM)和钙释放激活的钙通道蛋白(calcium release-activated calcium channel protein, CRAR,也叫做Orai)组成。STIM是一个定位在内质网膜上的单次跨膜蛋白,它的主要作用为监测内质网腔中钙离子浓度。而Orai主要构成了细胞膜上的钙离子通道。钙池调控的钙离子内流(store operated calcium entry, SOCE)与钙平衡之间关系密切,当内质网中的钙离子浓度降低,STIM转位到细胞膜从而激活Orai等构成的钙离子通道,促进钙离子内流以提高内质网腔钙离子浓度,并为细胞浆补充钙离子。近年来的研究表明SOCE参与了帕金森病、阿尔茨海默病等多种神经退行性疾病的病理生理过程,其主要是通过调整SOCs开放频率和改变细胞内钙离子浓度来实现的。然而,SOCE是否参与了高血糖导致的海马神经元损伤及认知功能障碍,我们不得而知。因此,本实验旨在通过高糖刺激原代培养的神经元细胞,研究SOCE是否参与其中以及详细的作用机制。同时,本实验也通过链脲佐菌素(streptozocin, STZ)诱导斯普拉格道利(Sprague Dawley, SD)大鼠糖尿病模型,研究SOCE在糖尿病大鼠海马组织损伤中的作用,并且通过体内外阻断SOCE观察其在缓解海马神经元损伤中的效果,为深入研究高血糖导致的神经元损伤的分子机制和糖尿病认知功能障碍的发病机制提供新的实验室基础。第一部分：钙离子在高糖导致的神经元损伤中的作用目的：通过检测高糖刺激之后神经元的损伤情况以及细胞浆中游离钙离子浓度(cytoplasmic free Ca2+concentration, [Ca2+]cyt),在此基础上给予细胞内外钙离子螯合剂后,再次检测细胞浆中钙离子浓度以及神经元的损伤情况,探讨钙离子在高糖诱导的神经元损伤中的作用。方法：1.细胞培养：取18天孕龄的SD孕鼠,按照常规步骤取脑、剪碎、消化及计数后,将神经元接种于含Neurobasal+B27培养基且预先铺有多聚赖氨酸(Poly-D-lysine, PDL)的6孔板或96孔板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每3天进行半量换液。2.细胞处理分组：原代培养的神经元常规培养后,分组并给予不同浓度的葡萄糖(0、25mM、50mM、75mM、100mM)刺激48h。各组分别为：正常对照组,高糖组,高糖+乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)组及高糖+BAPTA-AM (1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid,BAPTA-AM)组。3.检测神经元胞浆中钙离子浓度：将细胞中的钙离子使用Fluo-3/AM标记,使用流式细胞仪检测神经元胞浆中游离钙离子的浓度。4.神经元损伤情况的评估：采用MTT法检测各组中神经元的存活率,以对神经元的损伤情况进行评估及选择最佳葡萄糖刺激浓度。结果：1.高糖对神经元的损伤：0、25mM、50mM、75mM、100mM的葡萄糖浓度依赖性的降低神经元的存活率。其中50mM的葡萄糖刺激48h后神经元的存活率为54.29%±3.17%,所以选取50mM的葡萄糖作为下一步的刺激浓度。2.不同浓度葡萄糖对神经元胞浆中游离钙离子浓度的影响：0、25mM、50mM、 75mM、100mM的葡萄糖浓度依赖性的升高原代培养的神经元胞浆中游离钙离子的浓度。3.不同的钙离子螯合剂对神经元胞浆中游离钙离子浓度的影响：不管是细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM还是细胞外钙离子螯合剂EDTA,二者都可降低高糖升高的神经元胞浆中钙离子浓度,二者之间无统计学差别。4.钙离子螯合剂对于神经元损伤的影响：细胞内钙离子螫合剂BAPTA-AM和细胞外钙离子螯合剂EDTA都升高了由于高糖刺激而降低的细胞存活率,二者之间无显着的统计学差别。结论：1.葡萄糖可浓度依赖性的降低原代培养的神经元的存活率2.钙离子可能在高糖导致的神经元损伤中发挥作用。第二部分：SOCE在高糖诱导的神经元损伤中的作用机制的研究目的：检测高糖刺激后SOCE相关蛋白分子STIM1在基因及蛋白水平的表达,然后通过SOCs药物阻断剂和siRNA技术抑制SOCE,再检测胞浆中游离钙离子浓度及神经元存活率,并使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率及线粒体膜势能的变化,分别检测神经元胞浆及线粒体中细胞色素C (Cytochrome C, CytC)的变化,使用western blot技术观察不同凋亡蛋白的变化,以此探讨SOCE在高糖诱导的神经元损伤中的作用机制。方法：1.神经元转染及转染效率的检测：试剂公司设计并合成针对STIM1的小干扰RNA (small interference siRNA)序列。常规利用转染试剂脂质体2000将合成的特异性siRNA转染到原代培养的神经元中,4-6小时后换液,48小时后提取蛋白,通过qPCR及western blot验证转染的效率。2.细胞干预分组：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)组、50mM葡萄糖刺激24小时组、48小时组、72小时组；PBS组、50mM葡萄糖组、葡萄糖+si-control组、葡萄糖+La3+组、葡萄糖+siRNA STIM1干扰组。3.检测STIM1的表达量：在以上刺激的终点,常规提取各组的总RNA及总蛋白,分别使用qPCR及western blot技术检测高糖诱导后STIM1的基因及蛋白的表达变化。4.检测各组胞浆中游离钙离子浓度的变化：在各组刺激结束后,使用流式细胞仪检测各刺激组中原代培养的神经元胞浆中钙离子浓度的变化。5.检测神经元的损伤情况：在各组刺激结束后,通过MTT法检测各刺激组神经元的存活率。6.检测各刺激组细胞凋亡率、线粒体膜势能(mitochondrial membrane potential, MMP):在各组刺激结束后,收集各组的细胞,给予Annexin-V/PI及罗丹明123 (Rhodamine123, Rh123),然后通过流式细胞仪观察各组细胞的凋亡率及线粒体膜势能的变化。7.检测各刺激组细胞胞浆及线粒体中的CytC的含量及凋亡蛋白的表达情况：分别收集神经元的胞浆及线粒体,检测胞浆及线粒体中CytC的含量,并通过western blot技术观察各凋亡蛋白的表达量。结果：1.针对STIM1的siRNA的鉴定：试剂公司设计合成针对STIM1的siRNA,通过qPCR及western blot检测发现siRNA可明显的抑制STIM1的基因及蛋白表达量。2.高糖对STIM1表达的影响：与对照组相比,50mM葡萄糖明显增加了STIM1的基因及蛋白的表达量,且影响至少持续达72小时。3.各刺激组神经元胞浆中游离钙离子浓度的变化：与对照组相比,La3+、siRNA STIM1均可明显降低高糖刺激而升高的钙离子浓度,且两组之间无显着的统计学上的差别。4.阻断SOCE及siRNA干扰后对神经元损伤的影响：与对照组相比,La3+、siRNA STIM1均可明显升高高糖降低的细胞存活率,且两组之间无显着的统计学上的差别。5.各刺激组细胞凋亡率及线粒体膜势能的变化：与对照组相比,50mM葡萄糖刺激后神经元凋亡率明显升高；线粒体膜势能大幅降低；与高糖刺激组相比,La3+、siRNA STIM1可降低神经元的凋亡率,提升线粒体膜势能。6.各刺激组CytC的变化：与对照组相比,高糖刺激组胞浆中CytC含量增加,而线粒体中CytC含量减少；与高糖刺激组相比,SOCE被阻断后胞浆中CytC含量相对减少,同时线粒体中CytC的含量相对增加,提示阻断SOCE可明显减少线粒体中的CytC释放入胞浆。7.各刺激组STIM1及各凋亡蛋白表达的变化：与对照组相比,高糖刺激组STIM1表达增加,凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值增加,增加了caspase3的活化；与高糖刺激组相比,阻断SOCE可降低STIM1的表达,也降低了高糖刺激增加的Bax/Bcl-2比值,减少了caspase3的激活。结论：1.高糖可明显的增加SOCE相关蛋白STIM1的基因及蛋白表达。2. SOCE可能通过诱导凋亡促进神经元损伤。第叁部分：SOCE在高血糖导致的糖尿病大鼠海马组织损伤中的作用机制的研究目的：通过免疫组化及western blot技术检测各组大鼠SOCE相关蛋白分子STIM1的表达情况,通过尼氏染色观察海马神经元的损伤情况,通过Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能,然后给予SOCE阻断剂科罗索酸后,观察以上指标的改变情况。同时检测大鼠海马组织线粒体中CytC的变化,通过western blot检测各凋亡蛋白的变化,进一步分析SOCE在高血糖导致的大鼠海马组织损伤中的作用机制。方法：1.体内实验的分组：将80只成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组,糖尿病组,糖尿病+科罗索酸治疗1组(1mg/kg,溶于2ml生理盐水),糖尿病±科罗索酸治疗2组(2mg/kg,溶于2ml生理盐水)。糖尿病大鼠模型：60只大鼠腹腔注射STZ (50mg/kg,溶于10mM、pH4.5的柠檬酸盐溶液),48h后采集尾静脉血测空腹血糖,空腹血糖浓度大于250mg/dl即认为造模成功。正常组给予等量的生理盐水腹腔注射。科罗索酸1组：从第5周起,每天固定时间给予1mg/kg的科罗索酸灌胃,共治疗12周。科罗索酸2组：从第5周起,每天固定时间给予2mg/kg的科罗索酸灌胃,共治疗12周。对照组和糖尿病组给予等量生理盐水灌胃。治疗12周结束后,各组给予Morris水迷宫实验。大鼠在实验前后称重,留取血样,并将脑组织放入液氮或甲醛中备用。2.检测各组STIM1的表达情况：通过western blot和免疫组化检测各处理组STIM1蛋白的表达情况。3.检测各组脑组织的损伤情况：通过尼氏染色观察各处理组海马组织的病理变化。4.检测各处理组线粒体中的CytC的含量：分别收集各组海马组织的线粒体部分,检测线粒体中CytC的含量。5.检测各处理组凋亡蛋白的表达情况：分别提取各组海马组织的蛋白,通过western blot检测各凋亡蛋白的表达量。结果：1.糖尿病大鼠认知功能的变化：在Morris水迷宫实验中,与正常对照组相比,糖尿病大鼠潜逃时间延长,在目标象限停留时间百分比缩短；同时,各组游泳速度没有差异。2.糖尿病大鼠脑组织病理改变：尼氏染色发现糖尿病大鼠海马CA1区神经元锥体细胞排列疏松,部分神经元脱失,胞浆内尼氏小体数目减少；对照组大鼠CA1区神经元锥体细胞排列整齐,结构清楚,形态完整,尼氏体丰富。3.糖尿病大鼠脑组织STIM1及各凋亡蛋白表达的变化：与对照组大鼠相比,糖尿病大鼠脑组织中SOCE相关蛋白分子STIM1的表达明显增加,凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值增加,caspase3活化增加,提示增加了神经元凋亡。4.药物干预对于大鼠认知功能及脑组织损伤的影响：与糖尿病大鼠组相比,药物干预能明显缩短大鼠潜逃时间,增加目标象限停留时间百分比。药物干预组大鼠海马CA1区神经元锥体细胞排列紧密,结构清晰,尼氏体数目增多。5.抑制SOCE对CytC的影响：与糖尿病组相比,药物干预组线粒体中CytC的含量相对增加,说明抑制SOCE能显着抑制线粒体中的CytC的释放。6.阻断SOCE对于STIM1及各凋亡蛋白表达的影响：与糖尿病组相比,抑制SOCE不仅抑制了STIM1的蛋白表达,也降低了高血糖刺激增加的Bax/Bcl-2的比值,减少了caspase3的激活,提示减少了神经元凋亡。结论：1. SOCE可能通过诱导海马组织神经元凋亡而导致海马组织损伤,从而导致糖尿病大鼠认知功能障碍。2.抑制SOCE后显着减轻了海马组织损伤,改善了糖尿病大鼠认知功能障碍。(本文来源于《山东大学》期刊2016-09-24）
景钊[9]（2016）在《钙库操纵性钙内流抑制剂SKF-96365抗结肠癌作用及机制研究》一文中研究指出结肠癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤,当前以外科手术与化疗为主的综合治疗效果仍不理想,治疗后仍有约50%以上的患者出现复发与转移。因此,寻找新的治疗靶点与治疗策略以进一步改善患者预后,是目前结肠癌治疗中亟需解决的问题。钙离子(Ca2+)作为重要的第二信使参与调节许多细胞基本生理功能,并与肿瘤的浸润、转移和血管生成等恶性表型密切相关。细胞内钙离子稳态的维持依靠细胞内钙库Ca2+的释放与细胞外Ca2+的内流。钙库操纵性Ca2+内流(store-operated calcium entry, SOCE)是Ca2+进入肿瘤细胞内的主要方式,靶向SOCE的抑制剂有望成为新的抗肿瘤药物。SKF-96365是钙库操纵性钙内流抑制剂,能够明显抑制非兴奋细胞中的SOCE过程。研究发现SKF-96365能够抑制多种肿瘤细胞的增殖。目前,SKF-96365在结肠癌中的抗肿瘤作用及其分子机制尚不清楚。目的研究SKF-96365对结肠癌细胞的抗肿瘤作用,及对细胞周期、凋亡、自噬水平的影响；分析SKF-96365抗肿瘤作用可能的分子机制及自噬在此过程中所发挥的作用；在此基础上观察抑制自噬是否增加结肠癌细胞对SKF-96365的敏感性。方法通过激光共聚焦显微镜观察SKF-96365对结肠癌细胞SOCE过程的影响；MTS检测SKF-96365对结肠癌细胞存活的影响；流式细胞仪、Western blot等方法观察SKF-96365对细胞周期和凋亡的影响；Western blot、免疫荧光与透射电镜等方法观察SKF-96365处理对结肠癌细胞自噬相关蛋白表达及自噬体形成的影响；抗体芯片及生物信息学分析SKF-96365处理后结肠癌细胞中重要信号通路的表达变化情况；MTS方法检测,自噬抑制剂或下调自噬调控基因Beclinl抑制自噬对SKF-96365抗肿瘤作用的影响；采用流式细胞仪检测抑制自噬前后细胞凋亡率的变化；建立结肠癌裸鼠移植瘤模型验证自噬抑制剂对SKF-96365的增敏作用。结果SKF-96365能够抑制结肠癌细胞株SOCE介导的钙离子内流,并能有效抑制HCT116与HT29细胞生长,其机制在于诱导结肠癌细胞G2/M期阻滞和凋亡。同时,我们发现SKF-96365可以诱导结肠癌细胞自噬,并证实SKF-96365诱导的自噬先于凋亡发生。自噬通过抑制细胞色素c从线粒体的释放,从而延缓凋亡的发生,为细胞提供保护。为进一步明确SKF-96365诱导结肠癌细胞凋亡及自噬的分子机制,我们采用抗体芯片检测SKF-96365作用前后细胞内主要信号传导通路的变化,发现SKF-96365能够显着抑制AKT/mTOR信号通路。结合生物信息学分析,我们预测并证实钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱγ亚型(CaMKIIγ)在SKF-96365抗肿瘤过程中起到关键作用,其可以磷酸化AKT S473位点,进而激活AKT/mTOR信号通路。而AKT/mTOR信号通路在肿瘤增殖、凋亡及自噬过程中发挥了重要作用。过表达CaMKIIγ或AKT1,可以减弱SKF-96365诱导的肠癌细胞自噬与凋亡水平。体外研究表明,抑制自噬可以提高SKF-96365对结肠癌细胞的生长抑制作用。不同浓度的SKF-96365联合自噬抑制剂CQ或3-MA作用于HCT116和HT29细胞后,对其抑制作用显着高于SKF-96365单药组,(p<0.001)。以siRNA Beclinl转染HCT116和HT29细胞,也能够显着提高肿瘤细胞对SKF-96365的敏感性。流式细胞仪检测结果显示与SKF-96365单药处理相比,联合CQ和3-MA时,细胞凋亡率显着增加(p<0.05),但对于SKF-96365诱导的G2/M期阻滞未见明显作用。裸鼠移植瘤结果表明自噬抑制剂HCQ可以增加SKF-96365对HCT116移植瘤的抑制作用。SKF-96365联合HCQ组肿瘤体积较对照组缩小约48.4%,且未观察到明显毒性反应。与体外研究结果一致,Western blot与免疫组化检测发现,SKF-96365处理组微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达水平明显升高。SKF-96365联合HCQ组较SKF-96365单药组凋亡更为明显。同时我们进一步证实,SKF-96365抑制了肿瘤组织中CaMKIIγ/AKT/mTOR信号通路的激活。结论SKF-96365能够明显抑制结肠癌细胞SOCE介导的钙离子内流,从而抑制结肠癌细胞生长,其机制是通过抑制钙离子/CaMKIIγ/AKT信号传导通路,导致细胞周期阻滞、凋亡与自噬。抑制自噬促进SKF-96365在体内外对结肠癌细胞的生长抑制作用,提高细胞凋亡率。SOCE抑制剂SKF-96365联合自噬抑制剂有可能成为结肠癌的一种新的治疗策略。(本文来源于《浙江大学》期刊2016-05-01）
麦晓仪[10]（2016）在《抑制Orai1通道介导的Ca~(2+)内流减轻肾脏纤维化和肾功能损害及其机制研究》一文中研究指出肾脏纤维化是肾脏受到创伤、感染、炎症、血循环障碍,以及免疫反应等多种致病因素刺激后,其固有细胞受损,发展到后期出现大量胶原沉积和积聚,造成肾实质逐渐硬化,形成瘢痕,直至肾脏完全丧失脏器功能的病理生理过程。无论是原发性肾小球疾病,还是糖尿病、输尿管梗阻导致的肾功能损伤都与肾脏纤维化病变的程度密切相关。因此,肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)共同的病理特征,是终末期肾功能衰竭形成的重要原因。肾脏纤维化包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化,本质上以细胞外基质的过度积聚和沉积为主要特征。目前认为上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是导致肾间质纤维化的重要原因。EMT过程是指肾小管上皮细胞在一系列刺激因素的作用下,转化形成成纤维细胞,随后成纤维细胞增殖并产生过多的细胞外基质在肾组织沉积,最后引起肾小管缺失。肾小管上皮细胞发生EMT时,细胞变得细长并失去黏附性和极性;同时,细胞表达上皮标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、细胞角蛋白(cytokeratin)及紧密黏连蛋白-1(zonula occludens 1,ZO-1)减少,而间充质标志蛋白波形蛋白(vimentin)、a-SMA、钙结合蛋白S100A4、纤连蛋白(fibronectin,FN)、成纤维细胞特异蛋白-1(fibroblast-specific protein 1,FSP-1)及I、IV型胶原蛋白表达增加。转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)是诱导EMT的最强和最常见的刺激因子,其主要通过smad依赖性信号途径介导EMT。TGF-β1通过结合和激活跨膜丝/苏氨酸I型和II型受体,促进smad2与smad3磷酸化。磷酸化的smad2/3与smad4形成异聚体复合物,转移进入细胞核调控相关基因的转录,进而诱导肾小管上皮细胞EMT,促进肾脏纤维化的形成。因此,深入研究肾小管上皮细胞的EMT过程及调控机制对防治肾脏纤维化具有重要意义。钙离子(Ca~(2+))是细胞信号传导过程中重要的第二信使,细胞内Ca~(2+)稳态对维持细胞的正常生理功能起至关重要的作用,而Ca~(2+)稳态的失衡与肾脏疾病密切相关。早期研究发现,在肾脏纤维化的发展过程中,无论是在体肾脏组织还是离体成纤维细胞、足细胞和肾小管上皮细胞,钙通道表达或者胞内Ca~(2+)水平都有明显增加,揭示细胞内Ca~(2+)调控异常参与肾脏纤维化的发生发展过程,钙通道可能是防治肾脏纤维化的有效靶点。细胞膜上的钙离子通道是调控细胞内Ca~(2+)水平的主要途径。钙通道按其功能和特性可分为叁大类:电压依赖性钙通(voltage-dependent Ca~(2+)channel,VDCC)、受体操纵性钙通道(receptor-operated calcium channel,ROCC)和钙池操纵性钙通道(store-operated Ca~(2+)channel,SOCC)。其中VDCC主要表达于心肌细胞和神经细胞等兴奋性细胞中,参与神经递质的释放、平滑肌收缩、心脏起搏等生理功能。ROCC和SOCC则在兴奋性和非兴奋性细胞中均有表达,是介导非兴奋细胞Ca~(2+)内流的主要通道。以往研究发现肾小球系膜细胞、成纤维细胞和足细胞中均有ROCC和SOCC的表达,并参与了细胞增殖、迁移、收缩、基质生成等生理功能。近年来的研究表明Orai1与基质交互分子1(stromal interaction molecular1,Stim1)共同构成了SOCC的分子基础。Orai1是一种细胞膜蛋白,含有四个跨膜区(TM1-TM4),构成可以通过Ca~(2+)的孔道通道。Stim1分布在内质网上,作为Ca~(2+)浓度感受器。在钙池充盈的情况下,Stim1均匀分布于内质网膜上处于稳定状态。当细胞受到外界刺激引起钙池耗竭时,Stim1和Orai1同时向内质网-细胞膜最接近的地方移动并相互结合。此时,Orai1的孔道开放引起胞外Ca~(2+)进入细胞内。这一过程被认为是SOCC的激活机制。最近,有关Orai1通道在肾功能调控和肾脏疾病中的作用已引起关注。前期研究发现Orai1钙通道异常可能是肾小球疾病、慢性肾病和肾脏肿瘤发生的重要机制,而且Orai1钙通道在肾小球系膜细胞的增殖和基质形成、肾纤维母细胞转分化和肾透明细胞癌细胞增殖迁移等过程中均发挥了重要作用。但Orai1钙通道在肾小管上皮细胞的功能调控,特别在肾脏纤维化过程中作用,尚不清楚。Endophilin是一类富集吡咯氨酸SH3结构域的蛋白家族,而Endophilin A2是其中一类广泛分布在机体各组织和器官中的亚家族成员。早期人们对Endophilin A2的研究主要集中在其调控网格蛋白所介导的胞吞以及与电压依赖性钙通道(voltage-gated Ca~(2+)channels,VGCCs)相互作用调节突触囊泡内吞和调控神经元的兴奋性等过程。后来有研究报道,Endophilin A2可抑制金属蛋白酶的内吞,促进细胞外基质的降解,调控细胞内的信号转导。值得注意的是,最近有报道Endophilin A2可通过影响足细胞的胞吞作用而参与调控肾小球滤过和肾病综合征。这些结果为Endophilin A2在肾脏疾病领域的研究打开了新的篇章。然而,Endophilin A2在肾脏纤维化中的功能还远未被揭示。最近我们在研究Orai1对肾脏纤维化调控作用的过程中意外发现,Endophilin A2在纤维化的肾组织中蛋白表达下调了,在TGF-β1处理的肾小管上皮细胞中蛋白表达同样下调,而这一变化与Orai1蛋白表达呈负相关。这提示我们,Orai1钙通道和Endophilin A2可能是促进和抑制肾脏纤维化的关键机制。为了揭示Orai1通道介导的Ca~(2+)内流在肾脏纤维化的发展形成中的作用和机制,以及探讨Endophilin A2能否与Orai1钙通道联合参与调控肾脏纤维化,本课题主要从以下叁个方面开展研究工作:1.分别在高脂饮食诱导Apo E-/-小鼠肾脏纤维化和UUO诱导C57BL/6小鼠肾脏纤维化两种在体模型上,检测干预Orai1蛋白表达或抑制Orai1钙通道介导Ca~(2+)内流对肾脏纤维化形成及相关纤维化因子表达情况的影响;2.采用体外培养肾小管上皮细胞,从分子水平探讨Orai1钙通道调控肾脏纤维化形成的作用机制;3.分别在离体细胞水平和在体转基因小鼠肾脏纤维化模型上,研究Endophilin A2对肾脏纤维化发挥的作用。第一部分抑制Orai1钙通道可减轻高脂饮食和UUO诱导的小鼠肾脏纤维化的形成为了探讨Orai1钙通道是否参与调控肾脏纤维化的形成,我们在Apo E-/-小鼠高脂饮食诱导或UUO诱导的肾脏纤维化模型上检测了Orai1蛋白在肾脏的表达情况,并进一步通过沉默Orai1的蛋白表达或抑制Orai1钙通道的功能,观察小鼠肾脏纤维化形成情况。结果如下:肾皮质,在肾髓质中表达较少。而在肾皮质中,Orai1在肾小管中的表达高于肾小球。通过与肾小管标记物Na+/H+交换体NHE3免疫荧光共定位进一步证实,Orai1在肾皮质的表达主要集中在肾小管。同时,在离体细胞中也证明Orai1在肾小管上皮细胞中的表达高于肾小球系膜细胞,提示Orai1在肾小管上皮细胞中发挥着更重要的作用。1.通过免疫组化染色,检测出Orai1在Apo E-/-小鼠肾脏切片中主要集中表达在2.8周龄Apo E-/-小鼠,给予高脂饮食12周,观察肾皮质中Orai1的表达情况。结果显示,与正常饮食组相比,高脂饮食组的小鼠肾皮质Orai1蛋白表达和m RNA表达都明显增多。3.8周龄Apo E-/-小鼠,给予高脂饮食8周后,通过尾静脉注射Orai1干扰腺病毒载体(Ad-Orai1-sh RNA,5x109 pfu/只)沉默体内Orai1表达,或注射对照干扰腺病毒载体(Ad-GFP-sh RNA,5x109 pfu/只)作为阴性对照,继续高脂饮食4周后观察小鼠肾脏纤维化形成情况。结果显示:与Ad-GFP-sh RNA处理组相比,Ad-Orai1-sh RNA处理组Apo E-/-小鼠肾皮质中,Orai1的蛋白表达量和m RNA表达量均下降。通过Masson Thrichrome和Sirius Red染色观察Apo E-/-小鼠肾脏胶原蛋白表达情况,结果显示与正常饮食对照组相比,高脂饮食的Apo E-/-小鼠出现明显的肾脏纤维化病变。Ad-Orai1-sh RNA处理组小鼠肾小管间质中胶原着色面积明显低于Ad-GFP-sh RNA处理组。4.8周龄Apo E-/-小鼠,给予高脂饮食8周后,每天一次腹腔注射10 mg/kg的SKF96365或对照试剂PBS,同时高脂饮食。4周后通过Masson Thrichrome和Sirius Red染色观察小鼠肾脏胶原蛋白表达情况。结果显示:SKF96365处理组小鼠肾皮质中胶原表达明显低于PBS处理组。5.通过沉默Apo E-/-小鼠体内Orai1表达或者抑制Orai1钙通道活性,可以保护由高脂饮食诱导的小鼠肾脏功能损伤。结果显示,抑制Orai1钙通道可降低由高脂饮食引起的小鼠血清肌酐水平和尿蛋白含量的上升。6.与肾脏纤维化相关的因子包括有fibronectin、a-SMA、collagen I、III、IV、TGF-β1,smad3等。与正常饮食组相比,高脂饮食的Apo E-/-小鼠肾皮质中,上述纤维化相关因子的蛋白表达量都明显升高。而Ad-Orai1-sh RNA处理组与Ad-GFP-sh RNA处理组相比,上述纤维化相关因子的蛋白表达量则有明显的降低。同样,SFK96365处理组与PBS对照组相比,上述纤维化相关因子的蛋白表达量亦有明显的减少。通过免疫组化的方法分别检测fibronectin、a-SMA、collagen I、III、IV在不同处理组Apo E-/-小鼠肾脏中的蛋白表达情况,结果与Western blot结果一致。7.对12周龄的C57BL/6小鼠进行单侧输尿管闭塞手术(UUO)或假手术(sham)处理,分别在术后第1天和第3天通过尾静脉注射Orai1干扰腺病毒载体(Ad-Orai1-sh RNA,5x109pfu/只)或对照干扰腺病毒载体(Ad-GFP-sh RNA,5x109pfu/只),或者在术后每天腹腔注射10mg/kg的SKF96365或对照试剂PBS。分别在术后第7天和第14天处死小鼠,收集手术侧肾脏,观察纤维化病变情况。结果显示:Masson Thrichrome染色结果反映,与sham组相比,UUO组小鼠出现明显的肾脏纤维化病变。UUO-Ad-Orai1-sh RNA处理组和UUO-SFK96365处理组小鼠的肾脏纤维化程度都较对照组有明显的下降。8.Western blot和免疫组化分别检测sham和UUO模型组小鼠肾皮质fibronectin、a-SMA、TGF-β1和collagen I、III、IV蛋白表达情况,结果如下:假手术组中,上述纤维化因子蛋白表达在各处理组中均无明显差异。而UUO处理后,14天UUO诱导的上述纤维化因子蛋白表达比7天UUO明显增多;无论是7天UUO还是14天UUO,Ad-Orai1-sh RNA处理组小鼠肾皮质表达上述纤维化因子都较Ad-GFP-sh RNA处理组明显降低;同样,与PBS对照组相比,SKF96365处理组表达上述纤维化因子都明显减少。值得注意的是,Orai1和STIM1蛋白表达在UUO处理后的小鼠肾脏都有明显增加。9.从临床上收集了3例肾脏纤维化患者(分别是慢性肾小管-间质肾炎,Ig A肾病综合征和局灶增生性Ig A肾病综合征)和1例对照病例患者(微小病变肾病)的肾脏活检组织。Masson Trichrome染色表明在局灶增生性硬化和肾小管肾炎的患者肾脏组织有明显的纤维化病变,而微小病变肾病患者肾脏组织的纤维化病变轻微。免疫细胞化学染色显示Orai1高表达于肾小管上皮细胞,同时在肾小球细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等也有表达。免疫组织化学染色显示Orai1在肾脏纤维化患者的肾脏组织中的蛋白表达量都明显高于对照病例患者。表达较低。2.高脂饮食和单侧输尿管结扎均可诱导小鼠肾脏形成纤维化病变。Orai1在纤维化的肾脏中的表达量上调。3.Orai1在肾脏纤维化患者的肾脏组织中蛋白表达量增高。4.沉默Orai1的表达或者抑制Orai1钙通道,可降低由高脂饮食和UUO诱导的小鼠肾脏纤维化程度,改善肾功能。小结1.Orai1在肾脏中主要集中表达于肾皮质中的肾小管,而在肾髓质和肾小球中第二部分Orai1钙通道调控肾脏纤维化的作用机制为了进一步阐明Orai1钙通道参与调控肾脏纤维化的作用机制,本部分我们首先探讨了TGF-β1对肾小管上皮细胞胞内钙离子水平和纤维化相关因子表达的影响,并进一步从TGF-β/smad信号通路、Ca~(2+)-Ca MK II和Ca~(2+)-calcineurin信号通路研究了Orai1钙通道促进肾脏纤维化形成的分子机制。结果发现:1.人肾小管上皮细胞(HK2)转染Orai1干扰腺病毒载体(Ad-Orai1-sh RNA,200 MOI)后,Orai1蛋白表达明显降低。TGF-β1(5 ng/ml)处理HK2细胞可触发钙离子内流,而当沉默Orai1或STIM1蛋白表达后,由TGF-β1诱导的胞外Ca~(2+)内流则明显受到抑制。Ang II(100 nmol/l)同样可促进HK2细胞Ca~(2+)内流升高,抑制Orai1钙通道可降低由此引起的胞内钙离子水平的上升。2.TGF-β1(5 ng/ml)和Ang II(100 nmol/l)作用于HK2细胞48小时均可以诱导fibronectin和collagen IV的蛋白表达上调。当细胞转染Ad-Orai1-sh RNA抑制Orai1表达时,可降低TGF-β1和Ang II诱导的fibronectin和collagen IV蛋白表达增加。3.TGF-β1(5 ng/ml)作用于HK2细胞30 min可以明显诱导smad2/3的磷酸化水平升高,而沉默Orai1蛋白表达则明显抑制TGF-β1诱导的smad2/3磷酸化水平增加,而对smad2/3总蛋白表达无影响。同样,HK2细胞预孵育SOCC阻断剂SKF96365(20μmol/l)或钙释放抑制剂2-APB(100μmol/l)均可抑制TGF-β1诱导的smad2/3磷酸化水平升高,smad2/3总蛋白表达无明显变化。提示Orai1钙通道在HK2细胞中参与了TGF-β/smad信号通道。4.HK2细胞预孵育calcineurin抑制剂FK-506(10μmol/l)可以明显抑制TGF-β1诱导的smad2/3磷酸化水平升高和fibronectin、collagen IV蛋白表达增加,而预孵育Ca MK II抑制剂KN-93(10μmol/l)对smad2/3磷酸化水平和fibronectin、collagen IV蛋白表达均无明显影响。预孵育FK-506或KN-93均不影响HK2细胞smad2/3总蛋白表达。这说明Ca~(2+)-calcineurin而不是Ca~(2+)-Ca MK II信号介导了TGF-β1诱导的肾脏纤维化过程。5.TGF-β1(5 ng/ml)作用于细胞48小时可以诱导HK2细胞发生形态改变,包括细胞变成长梭形、过度增大,并失去细胞粘着性。同时,上皮细胞的标记物E-cadherin表达减低,而间质细胞的标记物a-SMA、vimentin和S100A4的表达增高。转染Ad-Orai1-sh RNA或预孵育SKF96365和2-APB抑制Orai1钙通道均可以逆转TGF-β1诱导的细胞形态改变,抑制E-cadherin表达下调以及a-SMA、vimentin和S100A4的表达上调。结果表明Orai1钙通道参与了TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的转分化过程。小结1.TGF-β1和Ang II均能引起HK2细胞胞内钙离子水平的增加,并能诱导细胞表达纤维化因子增加,其中TGF-β1的诱导作用比Ang II明显。2.沉默Orai1表达可显着抑制TGF-β1和Ang II诱导的HK2细胞Ca~(2+)内流升高和纤维化因子表达增加。3.Orai1钙通道介导的Ca~(2+)内流通过Ca~(2+)-calcineurin通路参与了TGF-β/smad信号的调控。4.阻断Orai1钙通道能抑制TGF-β1诱导的HK2细胞转分化,从而参与保护肾脏纤维化的发生发展。第叁部分Endophilin A2作为Orai1下游信号分子抑制肾脏纤维化形成结合前面的研究结果,为了进一步阐明Orai1钙通道参与保护肾脏纤维化的的调控机制,本部分我们在发现Orai1钙通道激活抑制Endophilin A2表达的基础上,进一步观察了Endophilin A2对HK2细胞生成细胞外基质的影响,并采用Endophilin A2转基因小鼠观察其对肾脏纤维化的影响。1.Endophilin A2在小鼠肾脏主要表达于肾小管上皮细胞,在髓质和肾小球中表达都较低。这一特性与Orai1蛋白的表达分布相一致。2.从前面UUO诱导的肾脏纤维化的小鼠中发现,Endophilin A2蛋白在纤维化的肾组织中表达减少;Ad-Orai1-sh RNA组小鼠肾皮质的Endophilin A2蛋白表达与Ad-GFP-sh RNA组相比明显增高。在HK2细胞中,TGF-β1处理后,Endophilin A2蛋白表达呈时间依赖性降低,而Orai1则呈时间依赖性增加。提示Endophilin A2参与了肾脏纤维化形成过程和肾小管上皮细胞的性状转变过程,并和Orai1有关联。3.前面我们发现,Orai1钙通道可以通过影响TGF-β/smad信号通道参与HK2细胞EMT过程。为了进一步探讨Endophilin A2在肾脏纤维化中的作用,我们随后研究了Endophilin A2在HK2细胞中对TGF-β/smad信号通道和细胞生成基质的作用。结果显示:过表达Endophilin A2可抑制TGF-β1诱导的smad3磷酸化和FN、collagen IV蛋白表达增高,而对smad3总蛋白表达无影响;沉默Endophilin A2可进一步增加TGF-β1诱导的smad3磷酸化和FN、collagen IV蛋白表达增高,smad3总蛋白表达亦无明显变化。表明Endophilin A2参与保护肾小管上皮细胞EMT。4.Endophilin A2转基因小鼠的鉴定:PCR结果显示有270 bp大小产物的即为转基因型小鼠;同时,Western blot结果显示,转基因小鼠肾脏Endophilin A2蛋白表达明显增多。5.正常状态下,Endophilin A2转基因小鼠肾脏形态与WT野生型小鼠无明显差异,但FN、a-SMA、TGF-β1和collagen I、III、IV蛋白在Endophilin A2转基因小鼠肾脏表达比WT小鼠的低。而当用UUO诱导小鼠形成肾脏纤维化时,Endophilin A2转基因小鼠肾脏纤维化病变程度明显轻于WT小鼠;同时,Endophilin A2转基因可抑制由UUO诱导的小鼠肾皮质表达FN、a-SMA、TGF-β1和collagen I、III、IV蛋白的增高。小结1.Endophilin A2在纤维化病变的肾脏和肾小管上皮细胞中表达逐渐减少,并与Orai1的表达呈负相关。2.抑制Orai1钙通道的活性可升高Endophilin A2的表达水平。发挥保护作用。3.Endophilin A2可抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT,并对肾脏纤维化结论1.Orai1在肾脏中主要表达在肾小管的上皮细胞,肾脏纤维化病变组织Orai1蛋白表达增加。2.抑制Orai1钙通道可减轻肾脏纤维化的病变程度,改善高脂血症诱导的肾功能损害。3.Orai1钙通道主要通过调控TGF-β/smad信号通路,促进肾小管上皮细胞的转分化,进而参与肾脏纤维化的调控。4.Endophilin A2表达受Orai1钙通道调控,高表达Endophilin A2抑制TGF-β/smad信号通路,减轻肾脏纤维化。(本文来源于《中山大学》期刊2016-05-01）
内流机制论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
高血脂是心血管病与糖尿病的共同危险因素,然而临床上使用他汀类药物控制血脂却增加了患者新发糖尿病的风险。相反,家族性高胆固醇血症(FH)病人有较高的血脂并长期使用他汀类药物,这类患者罹患糖尿病的风险却降低了。考虑到FH病人主要是由低密度脂蛋白受体(LDLR)突变引起的,这使得LDLR介导的胆固醇代谢是否参与糖尿病的发病成为疑问。他汀类药物能够上调肝脏和某些组织的LDLR表达并促进胆固醇内流,有可能引起某些胰岛细胞"脂毒性"的发生。胰岛β细胞对胆固醇较敏感,少量胆固醇蓄积就能造成细胞功能障碍。本文旨在讨论LDLR在他汀类药物诱发的糖尿病中的病理角色,为降低该药的不良反应、促进2型糖尿病的防治提供新的思考。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
内流机制论文参考文献
[1].李琪飞,刘萌萌,张震,张建勋,刘谦.水泵水轮机制动工况内流特性分析[J].兰州理工大学学报.2019
[2].余琦,王章利,张光伟,徐仓宝.他汀类药物引起新发糖尿病风险升高的病理机制:LDLR介导胆固醇内流引起胰岛β细胞“脂毒性”[J].中国动脉硬化杂志.2018
[3].朱剑军.TNFα介导钙离子内流促进肝癌细胞凋亡的作用及机制研究[D].中国人民解放军空军军医大学.2018
[4].王慧芳.细胞外组蛋白通过Ca~(2+)内流激活线粒体通路介导Raw264.7细胞凋亡的机制及其研究[D].南方医科大学.2018
[5].饶维.容量性钙内流在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制研究[D].第四军医大学.2017
[6].赵真.低频振动对人脐静脉血管内皮细胞钙内流和自噬流的影响及分子机制[D].第二军医大学.2017
[7].李子源.弹性导热仿生功能表面内流减阻性能与机制实验研究[D].吉林大学.2017
[8].徐振宽.钙池调控的钙离子内流在高血糖诱导的神经元损伤中的作用机制研究[D].山东大学.2016
[9].景钊.钙库操纵性钙内流抑制剂SKF-96365抗结肠癌作用及机制研究[D].浙江大学.2016
[10].麦晓仪.抑制Orai1通道介导的Ca~(2+)内流减轻肾脏纤维化和肾功能损害及其机制研究[D].中山大学.2016
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