全文摘要
本发明提供了一种凝胶电泳体系，制备方法及使用其分离和检测低密度脂蛋白的方法，本发明得到的凝胶电泳体系通过调节其中凝胶电泳分离柱中聚丙烯酰胺的含量以及电泳缓冲液的种类，使其具有能够分离和检测血浆脂蛋白LDL的各个亚型的能力，具有如下优点：（1）分离效果和分辨率远优于现有产品，电泳操作工序和分离时间也进一步缩短；（2）仅需2层凝胶即可实现电泳分离和检测，而现有试剂盒产品需要至少3层凝胶；（3）成本低廉，生产成本小于6元，远低于现有LipoprintLDLSubfractionsKit试剂盒的120元，但检测和分离效果相同，甚至更优。
主设计要求
1.一种凝胶电泳体系，其特征在于，所述凝胶电泳体系包括凝胶电泳分离柱和电泳缓冲液；所述凝胶电泳分离柱包括依次叠加的第一电泳分离段和第二电泳分离段；所述第一电泳分离段为含有2.4~2.6wt%聚丙烯酰胺的凝胶柱，所述第二电泳分离段为含有3~3.3wt%聚丙烯酰胺的凝胶柱；所述第一电泳分离段和第二电泳分离段中的凝胶柱浸没在保存液中，所述保存液为含有蔗糖和甘油的Tris-盐酸缓冲溶液；所述Tris-盐酸缓冲溶液的pH值为6.5~7.5；所述保存液中蔗糖的浓度为20~30g\/L；所述保存液中甘油的浓度为2~3g\/L；所述电泳缓冲液包括由Tris、硼酸、EDTA和水配制成的混合液；所述电泳缓冲液的pH值为7.8~8.8；所述电泳缓冲液中Tris的浓度为6~12.5g\/L；所述电泳缓冲液中硼酸的浓度为3~6.5g\/L。
设计方案
1.一种凝胶电泳体系，其特征在于，所述凝胶电泳体系包括凝胶电泳分离柱和电泳缓 冲液；
所述凝胶电泳分离柱包括依次叠加的第一电泳分离段和第二电泳分离段；
所述第一电泳分离段为含有2.4~2.6 wt%聚丙烯酰胺的凝胶柱，所述第二电泳分离段 为含有3~3.3 wt%聚丙烯酰胺的凝胶柱；
所述第一电泳分离段和第二电泳分离段中的凝胶柱浸没在保存液中，所述保存液为含 有蔗糖和甘油的Tris-盐酸缓冲溶液；
所述Tris-盐酸缓冲溶液的pH值为6.5~7.5；
所述保存液中蔗糖的浓度为20~30 g\/L；
所述保存液中甘油的浓度为2~3 g\/L；
所述电泳缓冲液包括由Tris、硼酸、EDTA和水配制成的混合液；
所述电泳缓冲液的pH值为7.8~8.8；
所述电泳缓冲液中Tris的浓度为6~12.5 g\/L；
所述电泳缓冲液中硼酸的浓度为3~6.5 g\/L。
2.根据权利要求1所述的凝胶电泳体系，其特征在于，所述第一电泳分离段中凝胶柱的 长度≥0.5 cm。
3. 根据权利要求1所述的凝胶电泳体系，其特征在于，所述第一电泳分离段中凝胶柱 的长度为0.5~0.9 cm。
4. 根据权利要求1所述的凝胶电泳体系，其特征在于，所述第二电泳分离段中凝胶柱 的长度≥4.5 cm。
5. 根据权利要求1所述的凝胶电泳体系，其特征在于，所述第二电泳分离段中凝胶柱 的长度为4.5~6 cm。
6.根据权利要求1中所述的凝胶电泳体系，其特征在于，所述电泳缓冲液中Tris和硼酸 的质量比为1.6~2:1。
7.根据权利要求1中所述的凝胶电泳体系，其特征在于，所述电泳缓冲液中Tris和硼酸 的质量比为1.9~2:1。
8.一种如权利要求1~7之一所述的凝胶电泳体系的制备方法，其特征在于，所述电泳分 离柱的制备方法包括如下步骤：
步骤（1），配制含有丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的凝胶母液，将第一浓度的凝胶母液、 Tris-盐酸缓冲溶液、TEMED、过硫酸铵、蔗糖、甘油和水混合，混合液灌注入底端密封的管 内，成胶后得到聚丙烯酰胺含量为3~3.3 wt%的凝胶柱，即为第二电泳分离段；
步骤（2），将第二浓度的凝胶母液、Tris-盐酸缓冲溶液、TEMED、过硫酸铵、蔗糖、甘油和 水混合，混合液灌注入步骤（1）中得到的第二电泳分离段的凝胶柱之上，成胶后得到聚丙烯 酰胺含量为2.4~2.6 wt%的凝胶柱，即为第一电泳分离段；
步骤（3），将步骤（2）得到的含第一电泳分离段和第二电泳分离段的结构浸没在保存液 中，得到所述电泳分离柱，所述保存液为含有蔗糖和甘油的Tris-盐酸缓冲溶液；
所述电泳缓冲液的制备方法包括如下步骤：
将Tris、硼酸、EDTA和水配制成的混合液，得到所述电泳缓冲液。
9.一种血浆中不同亚型的低密度脂蛋白的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括 如下步骤：
步骤（a），将如权利要求1~7之一所述的凝胶电泳体系中的凝胶电泳分离柱固定在电泳 槽中，其中的第一电泳分离段位于电泳槽的负极端，第二电泳分离段位于电泳槽的正极端， 在电泳槽中加入电泳缓冲液，将染色后的血浆沉降于第一电泳分离段的凝胶柱表面；
步骤（b），待凝胶电泳体系中的溶液稳定后进行电泳，在凝胶电泳分离柱的第二电泳分 离段中得到经过分离的不同亚型的低密度脂蛋白LDL-1、LDL-2、LDL-3、LDL-4、LDL-5、LDL-6 和LDL-7。
10.一种血浆中不同亚型的低密度脂蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述定量检测 方法包括如下步骤：
步骤（a’），使用染色液对血浆进行染色；
步骤（b’），将如权利要求1~7之一所述的凝胶电泳体系中的凝胶电泳分离柱固定在电 泳槽中，其中的第一电泳分离段位于电泳槽的负极端，第二电泳分离段位于电泳槽的正极 端，在电泳槽中加入电泳缓冲液，将染色后的血浆沉降于第一电泳分离段的凝胶柱表面；
步骤（c’），待凝胶电泳体系中的溶液稳定后进行电泳，在凝胶电泳分离柱的第二电泳 分离段中得到位于不同区域的经过分离的被染色的不同亚型的低密度脂蛋白LDL-1、LDL- 2、LDL-3、LDL-4、LDL-5、LDL-6和LDL-7；
步骤（d’），使用扫描仪扫描凝胶电泳分离柱中的第一电泳分离段和第二电泳分离段中 不同位置的吸光度变化，根据不同亚型的低密度脂蛋白的吸光度随位置变化得到的曲线， 定量检测不同亚型的低密度脂蛋白占所有血浆脂蛋白的百分比。
设计说明书
技术领域
本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种凝胶电泳体系，制备方法及使用其分离 和检测低密度脂蛋白的方法。
背景技术
心血管疾病是严重威胁人类的疾病，高血压、血脂异常、糖尿病、家族史、性别和年 龄、吸烟、肥胖等多种因素均会导致该病的发生，其中，血脂异常是诱发心血管疾病发生及 死亡的重要危险因素，《中国成年人血脂异常预防指南（2016年修订版）》和欧洲心脏病学会 联合欧洲动脉硬化学会发布的《血脂异常管理指南》共同指出低密度脂蛋白胆固醇（Low Density Lipoproteins-cholesterol， LDL）的含量属于导致血脂异常的一类因素，并建议 以降低血浆中LDL的水平作为血脂管理最重要的干预目标。
然而，近年来的研究发现，部分高水平LDL的人群在临床上并无冠心病的表现，同 时部分明确诊断为冠心病的患者其LDL水平却较正常人群偏低，且有部分患者服用药物降 低LDL后仍发生冠心病事件，上述结果提示我们，正常水平的LDL并不能完全代表心血管疾 病的低风险，因此需要进一步深入研究血浆中LDL及其各种亚型的含量与心血管疾病的相 关性。
LDL具有异质性，由一系列大小、密度和化学组成各异的颗粒组成，根据LDL颗粒的 直径和密度，可以将其分为至多7种亚型，分别被命名为LDL-1、LDL-2、LDL-3、LDL-4、LDL-5、 LDL-6和LDL-7。其中，大而轻的LDL（Larger buoyant LDL，lbLDL）由颗粒直径>27 nm，密度< 1.03 g\/mL的LDL-1和LDL-2组成，被定义为A型；小而密的LDL（Small dense LDL，sdLDL）由 颗粒直径<26 nm，密度>1.04 g\/mL的LDL-3~LDL-7组成，被定义为为B型。实验表明，用sdLDL 的水平作为预测和评估心血管疾病风险的指标更为精准，可见，对LDL及其各亚组分水平的 全面分析能够更准确的反映心血管疾病患者体内脂蛋白的真实水平，为早期发现并降低罹 患心血管疾病风险提供更有价值的临床参考指标。
多年以来人们致力于探索血浆脂蛋白检测的方法，其中电泳技术是一种比较传统 的手段，经改进后具有高效和实用的优点，至今仍被广泛应用于脂蛋白的分离和检测研究， 尤其是是聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中含有的聚丙烯酰胺凝胶兼有分子筛和电荷分离的双重 效应，分辨率较高，能够将血清脂蛋白分离出4条或更多的区带，具有透明度强、分离时间 快、电渗作用小、操作简便、易于掌握等优点。最初的聚丙烯凝胶电泳法是由Ornstein、 Davis以及Leammli 等人提出的，被广泛用于蛋白质的生物化学医药分析，然而，传统的凝 胶系统对血浆脂蛋白的分辨率较低，使用的凝胶体系多为高pH的碱性系统，会导致聚丙烯 酰胺凝胶不断水解，即使在2℃~8℃环境下至多保存2周，传统的凝胶体系就会丧失分离效 果，水解缩短了蛋白质的迁移距离，降低了蛋白质条带的分辨率，为保证实验效果，大多实 验室都使用现配的凝胶，这极大的制约了工作效率，并消耗了大量时间和人力，而且，市场 上的预制胶绝大多数都不能用于脂蛋白亚型的精细分离。
现有技术中常用于分离血浆中脂蛋白的凝胶电泳体系如CN1699406A中公开的凝 胶电泳体系，包括聚丙烯酰胺含量分别为3 wt%、3.6 wt%和7 wt%的分离胶1~3，其难以实现 血浆中LDL各个亚型的分离。而目前利用凝胶电泳对血浆中脂蛋白各亚型进行分离较为成 熟的，是由美国Quantimetrix公司研发生产的Lipoprint LDL Subfractions Kit试剂盒， 其不仅能够将LDL细化分类为7个亚组分以及检测各个亚组分的表达水平，还能同步检测CM （乳糜颗粒）、VLDL（极低密度脂蛋白）、LDL和HDL（高密度脂蛋白）水平及脂蛋白各组分在总 胆固醇中的占比，是目前FDA唯一批准用于低密度脂蛋白亚型检测分析的产品，然而，该产 品单价约折合人民币120元，进口成本很高。
因此，在现有技术的基础上，本领域的技术人员需要研发出一种廉价的新型凝胶 电泳体系，使其能够检测血浆中LDL的总量，并实现对LDL中各亚型的分离和检测，使得血浆 内脂蛋白的真实水平能够被进一步真实、全面、准确地检测得到。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种廉价的新型凝胶电泳体 系，使其能够检测血浆中LDL的总量，并实现对LDL中各亚型的分离和检测，使得血浆内脂蛋 白的真实水平能够被进一步真实、全面、准确地检测得到。
为达此目的，本发明的目的之一在于提供一种凝胶电泳体系，所述凝胶电泳体系 包括凝胶电泳分离柱和电泳缓冲液。
所述凝胶电泳分离柱包括依次叠加的第一电泳分离段和第二电泳分离段。
以凝胶柱的重量为基准，按重量百分数计算，所述第一电泳分离段为含有2.4~2.6 wt%（例如为2.45 wt%、2.5 wt%、2.55 wt%或2.58 wt%等）聚丙烯酰胺的凝胶柱，所述第二电 泳分离段为含有3~3.3 wt%（例如为3.05 wt%、3.10 wt%、3.15 wt%、3.25 wt%或3.28 wt% 等）聚丙烯酰胺的凝胶柱。
所述第一电泳分离段和第二电泳分离段中的凝胶柱浸没在保存液中，所述保存液 为含有蔗糖和甘油的Tris-盐酸缓冲溶液。
所述Tris-盐酸缓冲溶液的pH值为6.5~7.5，例如为6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、 7.3或7.4等。
所述保存液中蔗糖的浓度为20~30 g\/L，例如为21 g\/L、22 g\/L、23 g\/L、24 g\/L、 25 g\/L、26 g\/L、27 g\/L、28 g\/L或29 g\/L等。
所述保存液中甘油的浓度为2~3 g\/L，例如为2.1 g\/L、2.2 g\/L、2.3 g\/L、2.4 g\/ L、2.5 g\/L、2.6 g\/L、2.7 g\/L、2.8 g\/L或2.9 g\/L等。
所述电泳缓冲液包括由Tris（三羟甲基氨基甲烷）、硼酸、EDTA（乙二胺四乙酸）和 水配制成的混合液。
所述电泳缓冲液的pH值为7.8~8.8，例如为7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6或 8.7等。
所述电泳缓冲液中Tris的浓度为6~12.5 g\/L，例如为6.5 g\/L、7 g\/L、7.5 g\/L、8 g\/L、8.5 g\/L、9 g\/L、10 g\/L、10.5 g\/L、11g\/L、11.5 g\/L或12.3 g\/L等。
所述电泳缓冲液中硼酸的浓度为3~6.5 g\/L，例如为3.3 g\/L、3.5 g\/L、4 g\/L、4.3 g\/L、4.5 g\/L、4.8 g\/L、5.2 g\/L、5.5 g\/L、5.8 g\/L或6.2 g\/L等。
本发明限定了第一电泳分离段为含有2.4~2.6 wt%聚丙烯酰胺的凝胶柱，且第二 电泳分离段为含有3~3.3 wt%聚丙烯酰胺的凝胶柱，上述聚丙烯酰胺含量的凝胶柱用于分 离和检测LDL时具有更优的分离效率和电泳条带清晰度。
本发明中所述的凝胶电泳体系通过优选凝胶柱中聚丙烯酰胺的含量以及选用适 配的保存液和电泳缓冲液，能够实现血浆中LDL的各个亚型的分离，而且，由于其pH为近中 性环境，本发明所述的凝胶电泳体系能够在2~8℃下以凝胶状态保存12个月以上。
优选地，所述第一电泳分离段中凝胶柱的长度≥0.5 cm，例如为0.6 cm、0.8 cm、 0.9 cm、1.1 cm、1.3 cm、1.6 cm、1.8 cm或2.0 cm等，进一步优选为0.5~0.9 cm。
优选地，所述第二电泳分离段中凝胶柱的长度≥4.5 cm，例如为4.6 cm、4.8 cm、 5.1 cm、5.4 cm、5.7 cm、6.0 cm、6.5 cm、7.0 cm或7.5 cm等，进一步优选为4.5~6 cm。
上述长度范围的设置可以使得本发明直接适用于Quantimetrix LDL分析系统，使 其适用范围更广。
优选地，所述保存液中还添加有防腐剂。
优选地，所述防腐剂为美国SUPELCO公司生产的Proclin 300型防腐剂。
优选地，所述电泳缓冲液中Tris和硼酸的质量比为1.6~2:1，例如为1.65:1、1.7: 1、1.75:1、1.80:1、1.85:1、1.9:1或1.95:1等，进一步优选为1.9~2:1，Tris和硼酸的质量比 超过上述范围后，经过分离的不同亚型的低密度脂蛋白电泳条带的清晰度会相应降低。
优选地，所述电泳缓冲液中EDTA的浓度为2 mmol\/L。
本发明的目的之二在于提供一种所述凝胶电泳体系的制备方法，其中，所述电泳 分离柱的制备方法包括如下步骤：
步骤（1），配制含有丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的凝胶母液，将第一浓度的凝胶母 液、Tris-盐酸缓冲溶液、TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）、过硫酸铵、蔗糖、甘油和水混 合，混合液灌注入底端密封的管内，成胶后得到聚丙烯酰胺含量为3~3.3 wt%的凝胶柱，即 为第二电泳分离段；
步骤（2），将第二浓度的凝胶母液、Tris-盐酸缓冲溶液、TEMED、过硫酸铵、蔗糖、甘 油和水混合，混合液灌注入步骤（1）中得到的第二电泳分离段的凝胶柱之上，成胶后得到聚 丙烯酰胺含量为2.4~2.6 wt%的凝胶柱，即为第一电泳分离段；
步骤（3），将步骤（2）得到的含第一电泳分离段和第二电泳分离段的结构浸没在保 存液中，得到所述电泳分离柱，所述保存液为含有蔗糖和甘油的Tris-盐酸缓冲溶液。
所述第一浓度和第二浓度为能够使得聚丙烯酰胺含量满足限定范围的任意浓度。
所述电泳缓冲液的制备方法包括如下步骤：
将Tris、硼酸、EDTA和水配制成的混合液，得到所述电泳缓冲液。
优选地，所述底端密封的管为底端密封的透明玻璃管。
优选地，步骤（1）和步骤（2）中的混合液在灌注之前经过真空脱气处理，真空脱气 处理能够减少溶液中的气泡，提高得到的凝胶柱的整体质量。
优选地，步骤（1）和步骤（2）中的混合液在灌注之后，在液面上加入蒸馏水，再成 胶，上述步骤有利于使得得到的凝胶柱的表面平整，界面分明。
优选地，步骤（1）和步骤（2）中成胶的时间为30~60 min，例如为32 min、34 min、36 min、38 min、40 min、42 min、44 min、46 min、48 min、50 min、54 min或58 min等。
优选地，步骤（1）和步骤（2）中成胶的温度为20~40℃，例如为21℃、23℃、25℃、27 ℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃或39℃等。
优选地，步骤（1）和步骤（2）中在成胶后，用吸水纸吸除得到的凝胶柱表面的水分。
本发明的目的之三在于提供一种血浆中不同亚型的低密度脂蛋白的分离方法，所 述分离方法包括如下步骤：
步骤（a），将如前所述的凝胶电泳体系中的凝胶电泳分离柱固定在电泳槽中，其中 的第一电泳分离段位于电泳槽的负极端，第二电泳分离段位于电泳槽的正极端，在电泳槽 中加入电泳缓冲液，将染色后的血浆沉降于第一电泳分离段的凝胶柱表面；
步骤（b），待凝胶电泳体系中的溶液稳定后进行电泳，在凝胶电泳分离柱的第二电 泳分离段中得到经过分离的不同亚型的低密度脂蛋白LDL-1、LDL-2、LDL-3、LDL-4、LDL-5、 LDL-6和LDL-7。
本发明的目的之四在于提供一种血浆中不同亚型的低密度脂蛋白的定量检测方 法，所述定量检测方法包括如下步骤：
步骤（a’），使用染色液对血浆进行染色；
步骤（b’），将如前所述的凝胶电泳体系中的凝胶电泳分离柱固定在电泳槽中，其 中的第一电泳分离段位于电泳槽的负极端，第二电泳分离段位于电泳槽的正极端，在电泳 槽中加入电泳缓冲液，将染色后的血浆沉降于第一电泳分离段的凝胶柱表面；
步骤（c’），待凝胶电泳体系中的溶液稳定后进行电泳，在凝胶电泳分离柱的第二 电泳分离段中得到位于不同区域的经过分离的被染色的不同亚型的低密度脂蛋白LDL-1、 LDL-2、LDL-3、LDL-4、LDL-5、LDL-6和LDL-7；
步骤（d’），使用扫描仪扫描凝胶电泳分离柱中的第一电泳分离段和第二电泳分离 段中不同位置的吸光度变化，根据位于不同位置的不同亚型的低密度脂蛋白的吸光度随位 置变化得到的曲线，定量检测不同亚型的低密度脂蛋白占所有血浆脂蛋白的百分比。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值 范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括 的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明得到的凝胶电泳体系通过调节其中凝胶电泳分离柱中聚丙烯酰胺的含量 以及电泳缓冲液的种类，使其具有能够分离和检测血浆脂蛋白LDL的各个亚型的能力，具有 如下优点：
（1）分离效果和分辨率远优于现有产品，电泳操作工序和分离时间也进一步缩短；
（2）仅需2层凝胶即可实现电泳分离和检测，而现有试剂盒产品需要至少3层凝胶；
（3）成本低廉，适合大规模生产，生产成本小于6元，远低于现有Lipoprint LDL Subfractions Kit试剂盒的120元，但检测和分离效果相同，甚至更优。
附图说明
图1为本发明具体实施方式中实施例1得到的凝胶电泳体系在分离血浆中的脂蛋 白后，各种类型的脂蛋白在凝胶电泳分离柱中的位置的示意图。
图2为本发明具体实施方式中实施例1得到的凝胶电泳体系在检测血浆中脂蛋白 的过程中得到的检测图谱。
图3为本发明具体实施方式中对照例2中的现有试剂盒产品在检测血浆中脂蛋白 的过程中得到的检测图谱。
图4为本发明具体实施方式中实施例1得到的凝胶电泳体系在存放前，在经过电泳 分离血浆中的脂蛋白后，其凝胶电泳分离柱的照片。
图5为本发明具体实施方式中实施例1得到的凝胶电泳体系在存放后，在经过电泳 分离血浆中的脂蛋白后，其凝胶电泳分离柱的照片。
图6为本发明具体实施方式中对照例1得到的凝胶电泳体系在存放前，在经过电泳 分离血浆中的脂蛋白后，其凝胶电泳分离柱的照片。
图7为本发明具体实施方式中对照例1得到的凝胶电泳体系在存放后，在经过电泳 分离血浆中的脂蛋白后，其凝胶电泳分离柱的照片。
图8为本发明具体实施方式中对照例2中的现有试剂盒产品在经过电泳分离血浆 中的脂蛋白后，其凝胶电泳分离柱的照片。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
下列实施例和对照例中所用到的试剂均为Sigma-Aldrich公司生产的纯度＞99% 的市售试剂。
实施例1
分别配制如下溶液，以备制备凝胶柱时使用：
Tris-HCl溶液：将18.15g的Tris溶于蒸馏水中，用HCl调节其pH至6.7，之后定容至 100 mL，用孔径为0.45 μm的滤膜过滤上述溶液，在2~8℃下保存。
凝胶母液：将30 g丙烯酰胺和3 g甲叉双丙烯酰胺溶于蒸馏水中，定容至100 mL， 用孔径为0.45 μm的滤膜过滤上述溶液，在2~8℃下保存。
过硫酸铵溶液：将1 g过硫酸铵溶于蒸馏水中，定容至10 mL，用孔径为0.45 μm的 滤膜过滤上述溶液，即用即配。
EDTA溶液：将14.6 g EDTA溶于蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调节pH至8.0，蒸馏水定 容至100 mL，用孔径为0.45 μm的滤膜过滤上述溶液，在室温下保存。
蔗糖溶液：将25 g蔗糖溶于蒸馏水中，定容至100 mL，用孔径为0.45 μm的滤膜过 滤上述溶液，在2~8℃下保存。
甘油溶液：将25 mL甘油溶于蒸馏水中，定容至100 mL，用孔径为0.45 μm的滤膜过 滤上述溶液，在2~8℃下保存。
通过如下方法制备凝胶电泳体系，所述凝胶电泳体系包括凝胶电泳分离柱和电泳 缓冲液。
所述凝胶电泳分离柱通过如下方法制备：
步骤（1），准备洁净玻璃管若干，玻璃管要求为两端镂空且端口平整的管状玻璃 管，内径为6 mm，外径为7 mm，长为7.5 cm，透光较好且可见光扫描时无干扰影响，用封口膜 将上述玻璃管的一端密封，开口朝上，竖直固定于制胶支架上；
步骤（2），取1.5 mL Tris-HCl溶液、1.5 mL凝胶母液、15 μL TEMED、150 μL过硫酸 铵溶液、1.5 mL蔗糖溶液、150 μL甘油溶液、4.5 μL美国SUPELCO公司生产的Proclin 300型 防腐剂和10.18 mL蒸馏水均匀混合，配制成混合液，混合液经过真空脱气处理后，将其灌入 玻璃管中，灌注高度为6.0 cm，灌注完成后立即在液面上加入50 μL蒸馏水以隔绝空气和使 胶面平整，在20~40℃下静置30~60 min，待胶液凝结后，得到聚丙烯酰胺含量为3.3 wt%的 凝胶柱，将表层水倒出并用吸水纸将凝胶柱表面的水吸干，即为第二电泳分离段；
步骤（3），取0.2 mL Tris-HCl溶液、0.158 mL凝胶母液、2 μL TEMED、20 μL过硫酸 铵溶液、0.2 mL蔗糖溶液、20 μL甘油溶液、0.6 μL美国SUPELCO公司生产的Proclin 300型 防腐剂和1.4 mL蒸馏水均匀混合，配制成混合液，混合液经过真空脱气处理后，将其灌入第 二电泳分离段之上，灌注高度为0.9 cm，灌注完成后立即在液面上加入50 μL蒸馏水以隔绝 空气和使胶面平整，在20~40℃下静置30~60 min，待胶液凝结后，得到聚丙烯酰胺含量为 2.6 wt%的凝胶柱，将表层水倒出并用吸水纸将凝胶柱表面的水吸干，即为第一电泳分离 段；
步骤（4），将步骤（3）中含第一电泳分离段和第二电泳分离段的结构浸没在保存液 中，得到所述电泳分离柱，所述电泳分离柱在2~8℃下避光保存。
其中，步骤（4）中所述的保存液通过如下步骤制备：
将100 mL Tris-HCl溶液、25 g蔗糖、2.5 mL甘油、300 μL美国SUPELCO公司生产的 Proclin 300型防腐剂溶于蒸馏水，定容至1000 mL，用孔径为0.45 μm的滤膜过滤上述溶 液，得到所述保存液。
所述电泳缓冲液通过如下方法制备：
将54 g Tris和27.5 g 硼酸溶于蒸馏水，向其中加入20 mL EDTA溶液，定容至 1000 mL，之后稀释5倍，得到所述电泳缓冲液，pH为8.0。
实施例2
通过如下方法制备凝胶电泳体系：
与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中通过改变凝胶母液和蒸馏水的加入量，使得 制得的第二电泳分离段的凝胶柱中聚丙烯酰胺的含量为3 wt%。
实施例3
通过如下方法制备凝胶电泳体系：
与实施例1的区别仅在于，步骤（3）中通过改变凝胶母液和蒸馏水的加入量，使得 制得的第一电泳分离段的凝胶柱中聚丙烯酰胺的含量为2.4 wt%。
实施例4
通过如下方法制备凝胶电泳体系：
与实施例1的区别仅在于，电泳缓冲液中硼酸的加入量为33 g。
实施例5
通过如下方法制备凝胶电泳体系：
与实施例1的区别仅在于，其中使用的Tris-HCl溶液的pH为7.5。
实施例6
通过如下方法制备凝胶电泳体系：
与实施例1的区别仅在于，保存液中蔗糖的加入量为20 g\/L，甘油的加入量为3 mL。
实施例7
通过如下方法制备凝胶电泳体系：
与实施例1的区别仅在于，保存液中蔗糖的加入量为30 g\/L。
实施例8
通过如下方法制备凝胶电泳体系：
与实施例1的区别仅在于，电泳缓冲液中Tris的加入量为30.6 g，硼酸的加入量为 32.5 g，pH为7.8。
实施例9
通过如下方法制备凝胶电泳体系：
与实施例1的区别仅在于，电泳缓冲液中Tris的加入量为60 g，硼酸的加入量为 15.5 g，pH为8.8。
对照例1
通过如下方法制备凝胶电泳体系：
与实施例1的区别仅在于，步骤（2）中通过改变凝胶母液和蒸馏水的加入量，使得 制得的第二电泳分离段的凝胶柱中聚丙烯酰胺的含量为3.6 wt%。
对照例2
以Quantimetrix公司生产的Lipoprint LDL Subfractions Kit试剂盒作为对照 例2。
通过如下定量检测方法，分别利用实施例1~10和对照例1中所述的凝胶电泳体系 对血浆中不同亚型的低密度脂蛋白进行分离和定量检测，同时利用对照例2中所述的试剂 盒，根据其说明书所述的方法对相同血浆中不同亚型的低密度脂蛋白进行分离和定量检 测。
所述定量检测方法包括如下步骤：
步骤（a’），取50 μL血浆，向其中加入10 μL染色液，震荡混匀，在37℃下水浴30 min，之后以3000转\/min的转速离心上述血浆5 min，得到染色后的血浆，使用的血浆来自上 海宝藤医学检验所有限公司，为志愿者在空腹12 h后采集的血液，之后在2 h内分离出的血 浆，染色液为1.5 g\/L的苏丹黑（SB-B）的丙二醇溶液；
步骤（b’），将凝胶电泳体系中的凝胶电泳分离柱去除表面及玻璃管中的保存液， 底部悬空固定在圆盘电泳槽中，其中的第一电泳分离段位于电泳槽的负极端，第二电泳分 离段位于电泳槽的正极端，在电泳槽的上下槽中分别加入500 mL电泳缓冲液，将30 μL染色 后的血浆沉降于第一电泳分离段的凝胶柱表面；
步骤（c’），待凝胶电泳体系中的溶液稳定后进行电泳，设置电泳电流为3 mA\/管 （如使用的凝胶柱数量为1个，则电流设置为3 mA），电泳70 min后，在凝胶电泳分离柱的第 二电泳分离段中得到位于不同区域的经过分离的被染色的不同亚型的低密度脂蛋白LDL- 1、LDL-2、LDL-3、LDL-4、LDL-5、LDL-6和LDL-7；
步骤（d’），电泳结束后取出凝胶电泳分离柱，使用扫描仪扫描凝胶电泳分离柱中 的第一电泳分离段和第二电泳分离段中不同位置的吸光度变化，将扫描图像导入脂蛋白分 析软件进行定性定量分析并生成血浆脂蛋白检测图谱，根据不同亚型的低密度脂蛋白的吸 光度随位置变化得到的曲线，定量检测不同亚型的低密度脂蛋白占所有血浆脂蛋白的百分 比。
将本发明实施例1~9得到的凝胶电泳体系与对照例2中的现有试剂盒产品进行对 比，以证实本发明得到的凝胶电泳体系在低密度脂蛋白分离和检测领域的优势。
图1为本发明实施例1得到的凝胶电泳体系在分离血浆中的脂蛋白后，各种类型的 脂蛋白在凝胶电泳分离柱中的位置的示意图，其中，可以看出低密度脂蛋白LDL-1~LDL-7均 位于凝胶电泳分离柱的第二电泳分离段中。
图2和图3分别为本发明实施例1得到的凝胶电泳体系和对照例2中的现有试剂盒 产品在检测血浆中脂蛋白的过程中得到的检测图谱，其中可以明显看出，本发明和现有试 剂盒产品的检测图谱基本一致，但本发明得到的凝胶电泳体系在检测不同亚型的LDL时，在 图谱中可以明显看出曲线出现多个小尖峰，而现有的试剂盒产品得到的是单峰的平滑曲 线，这说明本发明得到的凝胶电泳体系在分离不同亚型的LDL时，相较于现有产品，分离效 果更好。
对各实施例和对照例得到的检测图谱进行对比可知，按照分离不同亚型的LDL时 检测图谱的清晰度和分辨率排序，结果依次为：实施例1≈实施例5≈实施例6≈实施例7＞ 实施例3＞实施例4＞实施例8≈实施例9＞实施例2＞对照例2＞对照例1，说明凝胶柱中聚 丙烯酰胺的含量以及电泳缓冲液的中硼酸的含量对于得到的凝胶电泳体系的分离LDL各亚 型的能力影响较大。
继续分别利用在37℃下存放18天（根据时温等效原理，相当于在8℃下存放12个 月）后的如实施例1~9和对照例1中所述的凝胶电泳体系，根据上述定量检测方法，对血浆中 不同亚型的低密度脂蛋白进行分离和定量检测。
图4和图5分别为本发明实施例1得到的凝胶电泳体系在存放前和存放后，在经过 电泳分离血浆中的脂蛋白后，其凝胶电泳分离柱的照片。
图6和图7分别为本发明对照例1得到的凝胶电泳体系在存放前和存放后，在经过 电泳分离血浆中的脂蛋白后，其凝胶电泳分离柱的照片。
图8为本发明对照例2中的现有试剂盒产品在经过电泳分离血浆中的脂蛋白后，其 凝胶电泳分离柱的照片。
从上述图4~图8中得到的电泳分离结果中进一步可以证实，本发明得到的凝胶电 泳体系在分离血浆中的脂蛋白LDL的各亚型时，得到的电泳条带相较于对照例1和对照例2 更为清晰，具有优异的分离效果，在长时间存放后，得到的电泳条带的清晰程度和位置均不 发生变化，说明本发明得到的凝胶电泳体系可以降低聚丙烯酰胺的水解，具有长达12个月 以上的保质期，有利于大规模商业化生产。
综上所述，本发明得到的凝胶电泳体系通过调节其中凝胶电泳分离柱中聚丙烯酰 胺的含量以及电泳缓冲液的种类，使其具有能够分离和检测血浆脂蛋白LDL的各个亚型的 能力，具有如下优点：（1）分离效果和分辨率远优于现有产品，电泳操作工序和分离时间也 进一步缩短；（2）仅需2层凝胶即可实现电泳分离和检测，而现有试剂盒产品需要至少3层凝 胶；（3）成本低廉，生产成本小于6元，远低于现有Lipoprint LDL Subfractions Kit试剂盒 的120元，但检测和分离效果相同，甚至更优。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭 露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
设计图
相关信息详情
申请码:申请号:CN201910029855.X
申请日:2019-01-14
公开号:CN109374717A
公开日:2019-02-22
国家:CN
国家/省市:31(上海)
授权编号:CN109374717B
授权时间:20190416
主分类号:G01N27/447
专利分类号:G01N27/447;G01N21/31
范畴分类:31E;
申请人:上海宝藤生物医药科技股份有限公司;上海宝藤医学检验所有限公司
第一申请人:上海宝藤生物医药科技股份有限公司
申请人地址:201203 上海市浦东新区中国（上海）自由贸易试验区张衡路180弄3号楼5层
发明人:刘亚;王政;许骋;楼敬伟
第一发明人:刘亚
当前权利人:上海宝藤生物医药科技股份有限公司;上海宝藤医学检验所有限公司
代理人:巩克栋
代理机构:11332
代理机构编号:北京品源专利代理有限公司
优先权:关键词:当前状态:审核中
类型名称:外观设计
标签：凝胶电泳论文; 电泳论文; 缓冲液论文; 聚丙烯酰胺论文; tris论文; 聚丙烯酰胺凝胶电泳论文; 电泳缓冲液论文; cm论文;