三磷酸腺苷法在指导膀胱移行细胞癌术后膀胱灌注化疗中的体外敏感性研究

周珅1杨建玲2王耀华3

1保定市第三医院药剂科河北保定071000;

2保定市儿童医院药剂科河北保定071000;

3河北大学附属医院药剂科河北保定071000

通讯作者：王耀华,女,1978、11,河北保定,沈阳药科,研究生，主管药师，河北大学附属医院

【摘要】

目的：探讨应用三磷酸腺苷生物荧光抗癌药物敏感性测验（ATP一TCA）技术指导膀胱癌进行化疗。方法:采用ATP对19例病人进行肿瘤药敏试验,根据实验结果进行个体化膀胱灌注治疗。并与同期26例使用比柔比星进行膀胱灌注化疗的病人作为对照组,观察两组病人术后肿瘤的复发情况。结果:⑴药敏组和对照组术后肿瘤的复发率差异具有统计学意义⑵药敏组中出现多重耐药相关性具有统计学意义。结论:采用ATP一TCA进行体外药物敏感性实验后采取个体化灌注化疗能够减少TCCB的复发。

【关键词】膀胱移行细胞癌;AfP一TCA法;多重耐药

【中图分类号】R3226+2

【文献标识码】B【文章编号】16748999(2013)12026002

膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤，在我国膀胱癌在泌尿系统肿瘤中占首位,且近年有上升趋势，膀胱癌中约90%为移行细胞癌［1］。膀胱癌易复发,常多中心发生,癌周常伴上皮异生,与膀胱癌术后复发、进展有关［2］。ATP一TCA法采用荧光素一荧光酶系统测定ATP浓度,能增强化疗敏感性和特异性,其结果重复性、稳定性较其他方法佳,易标准化。

1材料与方法

11标本的收集:选择本院泌尿外科收治经病理证实为TCCB并保留膀胱的病人19例，男14例,女5例;年龄27~83岁,平均年龄5747岁。病例分级:I级15例,Ⅱ级3例,Ⅲ级3例;病理分期:Tl期13例,T2期5例,T3期l例。

12主要仪器设备:C02培养箱(进口)，倒置显微镜(进口)，高速离心机(进口)，冰箱(进口)，荧光显微镜(进口)，培养所需的相关产品(培养基、一次性培养皿等)(进口)，培养基(国产)，96孔培养板(国产)，10ml无菌移液管(国产)，无菌试剂池(国产)，50ml无菌锥形塑料离心管(国产)，多道加样器(Zooul)(国产)，血细胞计数板(国产)，细胞培养箱(国产)，荧光发光检测仪(国产)，150一200目灭菌细胞筛(国产)，无菌平皿(国产)。

13主要试剂:ATP一TCA实验试剂(北京金紫晶生物医药技术有限公司生产)，组织消化酶，ATP提取液，荧光酶一荧光素系统，ATP生成抑制剂，荧光酶工作液，红细胞裂解液，ATP标准，0O15MPBSPH72，标本浸泡液，RPMI1640培养液(不含血清)，无菌去离子水，台盼兰溶液。

14实验方法

141肿瘤组织的收集和处理:临床上诊断为膀胱癌的患者,在行手术治疗时(包括开放手术及TUR一BT)留取较完整的新鲜肿瘤组织,放入消毒的生理盐水中送实验中心进行药敏实验.

142ATP一TCA法体外药物敏感性实验步骤:ATP一TCA体外肿瘤药物敏感性实验的主要步骤为①实体肿瘤单细胞悬液制备:将手术取下的较纯净新鲜瘤组织进行清洁后立即浸入RPM11640溶液中,在最短时间内(3小时内)送抵实验室，用PBS清洗其表面3次后,将标本置于标本浸泡液中浸泡15分钟,除去标本浸泡液,剥离肿瘤标本表面的结缔组织、纤维和脂肪,用无菌剪刀将标本剪碎成lmm3的碎块,然后将其转移至含组织消化液的离心管中。将离心管倾斜置于37℃孵育箱中孵育15一3小时,每隔15一30分钟振摇一次,使其充分消化。随后将消化好的混合液通过细胞筛.②肿瘤细胞接种于多孔板,设置不加药对照,在不同药物浓度(各药物的浓度依据其在人体中血药浓度峰值进行配制)作用下培养5一7d,药物分别为:丝裂霉素(浙江海正药业股份有限公司国药准字H330207861111172mg/支)、吡柔比星(深圳万乐药业有限公司国药准字H109301051210C610mg/支)、羟基喜树碱(湖北华源世纪药业国药准字H200445531205042ml:5mg)、甲氨喋吟(江苏恒瑞医药股份有限公司国药准字H320264431107041201g/支)、顺铂(齐鲁制药有限公司国药准字H200234602110302DB10mg/支)、氟尿嘧啶（天津金耀氨基酸有限公司国药准字H12020959201214110ml:250mg）。③配制荧光酶一荧光素系统工作液:将12ml荧光酶工作液加入到荧光酶一荧光素系统中,充分溶解混合,室温避光放置10分钟，用多道加样器自A一G,H(换枪头)行顺序将ATP提取液加入96孔培养板,每孔加入50ul,室温静置5分钟,等待测定。完成ATP提取以后,用多道加样器自96孔培养板A一G,H(换枪头)顺序依次吸出50ul上清液,对应加入到荧光测定板中。在荧光测定板中每孔加入50ul发光工作液,在微量振荡器上振荡10秒钟,立刻用荧光扫描仪测定,结果传输计算机。④软件分析药物各浓度抑制率,绘制抑制曲线,计算药物1C50和IC90,评估药物作用。

143药物评价标准

敏感:IC50<25%PPC及IC90<100%PPC

中度敏感:IC50<25%PPC及IC90>100%PPC

轻度敏感:IC50>25%PPC及IC90<100%PPC

耐药:ICSO>25%PPC及IC90>100%PPC

IC90:抑制90%肿瘤生长时的血浆峰值浓度百分比

IC50:抑制半数肿瘤生长时的血浆峰值浓度百分比

PPC:一定临床用药剂量对应的血浆峰值浓度

2统计分析方法

采用SPSS130进行处理，计量资料间的比较用t检验,计数资料间的比较用x2检验、两样本计数资料用Spearman非参数等级相关分析。

3结果

药敏组19例患者此次研究结果中显示;⑴在用于药敏实验的6种化疗药物中,吡柔比星在19例标本中有8(4210%)例是敏感的,在6种药物中其敏感性最高的,其次是丝裂霉素(2631%)。⑵19例标本中,多重耐药(对两种以上抗肿瘤药物耐药)的有14例(7368)%,其中出现对所有进行试验的药物均耐药的有3(1579%)例,其中一例术后3月内复发。

4讨论

药敏组和对照组的复发率差异有统计学意义,通过ATP一TCA法进行体外药物敏感性实验对TCCB患者进行个体化治疗,能够明显的减少患者的复发率,ATP一TCA为临床治疗TCCB提供有效的用药指导。在ATP一TCA法进行的药物敏感性实验中,多重耐药的出现与bel一xl的阳性表达关系密切,患者药物敏感性实验出现多重耐药,bcl一xl可作为预测TCCB出现耐药的指标。

参考文献

［1］周容祥,程继义.泌尿男生殖系肿瘤.人民卫生出版社.2001,246

［2］林蓉,李旭,陈威.同一膀胱癌的三个耐药细胞株和BIU一87膀胱癌细胞株的化疗药物敏感性研究.西安医科大学学报.2000,21:39一41

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