全文摘要
本实用新型涉及生物技术领域，具体涉及一种检测IDH2基因R172K突变的试剂盒。本实用新型提供了一种检测IDH2基因R172K突变的试剂盒，包括试剂盒本体和盒盖，所述盒盖通过卡扣结构与所述试剂盒本体扣合，所述试剂盒本体中设置有缓冲垫，所述缓冲垫上设置有用于容纳容器的圆孔，所述试剂盒本体设置有第一容器和第二容器；所述第一容器中设置有引物1试管、引物2试管和第一探针试管；以及所述第二容器设置有缓冲液的试管。本实用新型采用数字PCR的方法检测IDH2突变，优化了数字PCR的检测流程，突变平均丰度较高，准确度达到100％，并且具有较高的灵敏度和特异性，对癌症的预后及指导治疗有积极作用。
主设计要求
1.一种检测IDH2基因R172K突变的试剂盒，包括试剂盒本体(1)和盒盖(2)，所述盒盖(2)通过卡扣结构与所述试剂盒本体(1)扣合，所述试剂盒本体(1)中设置有缓冲垫(7)，所述缓冲垫上设置有用于容纳容器的圆孔(8)，其特征在于，所述试剂盒本体(1)设置有第一容器(3)和第二容器(4)；所述第一容器(3)中设置有引物1试管(31)、引物2试管(32)和第一探针试管(33)；以及所述第二容器(4)设置有缓冲液的试管(41)。
设计方案
1.一种检测IDH2基因R172K突变的试剂盒，包括试剂盒本体(1)和盒盖(2)，所述盒盖(2)通过卡扣结构与所述试剂盒本体(1)扣合，所述试剂盒本体(1)中设置有缓冲垫(7)，所述缓冲垫上设置有用于容纳容器的圆孔(8)，其特征在于，所述试剂盒本体(1)设置有第一容器(3)和第二容器(4)；
所述第一容器(3)中设置有引物1试管(31)、引物2试管(32)和第一探针试管(33)；以及
所述第二容器(4)设置有缓冲液的试管(41)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括第三容器(5)，所述第三容器(5)设置有引物3试管(51)、引物4试管(52)和第二探针试管(53)。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括第四容器(6)，所述第四容器(6)中设置有第一抽提试剂瓶(61)、第二抽提试剂瓶(62)、第三抽提试剂瓶(63)、第四抽提试剂瓶(64)、第五抽提试剂瓶(65)、第六抽提试剂瓶(66)和第七抽提试剂瓶(67)。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述试管和试剂瓶上贴有标签，用于辨识试样品。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述盒盖四周设置有扣体，所述盒盖通过所述扣体与所述试剂盒本体扣合。
设计说明书
技术领域
本实用新型涉及生物技术领域，具体涉及一种检测IDH2基因R172K突变的试剂盒。
背景技术
异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因，有IDH1和IDH2两种亚型，是三羧酸循环的重要酶，催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸。IDH1和IDH2突变通常发生在低级别神经胶质瘤和继发性高级别神经胶质瘤，在原发性恶性胶质瘤中较少见。这些突变改变IDH蛋白质的催化活性，影响胶质瘤的发生发展。神经胶质瘤患者中，存在IDH1或IDH2基因突变的预后好于野生型IDH。2008-2012年间陆续发现多种肿瘤(如神经胶质瘤、肉瘤、急性粒细胞白血病)存在IDH突变，突变位点是催化中心的精氨酸残基。IDH2基因定位于15q26.1，在密码子172的突变最常见(IDH2\/R172K)，主要发生于少突胶质细胞瘤。目前，IDH2\/R140和IDH2\/R172已经成为研究热点，可用于解释原发性与继发性恶性胶质瘤的临床特点差异。目前已经形成共识，IDH突变可作为继发性恶性胶质瘤诊断和预后的分子标志。
目前在基因检测方面，主要采用目标序列捕获和高通量测序技术，并结合生物信息学分析，获取目标区域的基因变异信息，然后采用Sanger、QPCR等方法进行验证，找出致病基因突变。这种方法可一次性检测很多个肿瘤相关基因、解读大量肿瘤药物，全面、系统、准确地解读肿瘤药物与基因的关系；然而这种方法成本高，周期长，并不适用于所有的患者，且后续仍需要Sanger、QPCR等方法进行验证。
因此，研发一种新型的数字PCR检测IDH2突变的试剂盒，准确高效地检测IDH2的突变，具有重大意义和市场价值。
实用新型内容
目前现有技术中存在的技术问题是，目前在基因检测方面，主要采用目标序列捕获和高通量测序技术，并结合生物信息学分析，获取目标区域的基因变异信息，然后采用Sanger、QPCR等方法进行验证，找出治病基因突变，然而这种方法成本高、周期长，并不适用于所有的患者。
本实用新型为了解决上述技术问题，提供了一种检测IDH2基因R172K突变的试剂盒。
本实用新型所述的试剂盒是长期测序实验过程中，充分研究总结IDH2基因的突变与机体的关系，结合对先进测序技术的探索，采用数字PCR对IDH2的突变进行检测，通过设计特异性的突变引物及探针序列，优化试剂盒内各组分各试剂的浓度及配方，最终得到的试剂盒高效简洁，具有较高的灵敏度和特异性，操作简单易行，耗时短，结果准确。
微滴式数字PCR(ddPCR)是数字PCR技术的一种。ddPCR系统将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳米级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标基团突变DNA片段，经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行荧光检测，因此具有极高的灵敏度，能用于检测血液中含量极低的肿瘤游离DNA。
具体来说，本实用新型提出了如下技术方案：
本实用新型提供了一种检测IDH2基因R172K突变的试剂盒，包括试剂盒本体1和盒盖2，所述盒盖2通过卡扣结构与所述试剂盒本体1扣合，所述试剂盒本体1中设置有缓冲垫7，所述缓冲垫上设置有用于容纳容器的圆孔8，其特征在于，所述试剂盒本体1设置有第一容器3和第二容器4；所述第一容器3中设置有引物1试管31、引物2试管32和第一探针试管33；以及所述第二容器4设置有缓冲液的试管41。
优选的，对于上述所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括第三容器5，所述第三容器5设置有引物3试管51、引物4试管52和第二探针试管53。
优选的，对于上述所述的试剂盒，其中，所述所述试剂盒还包括第四容器6，所述第四容器6中设置有第一抽提试剂瓶61、第二抽提试剂瓶62、第三抽提试剂瓶63、第四抽提试剂瓶64、第五抽提试剂瓶65、第六抽提试剂瓶66和第七抽提试剂瓶67。
优选的，对于上述所述的试剂盒，其中，试管和试剂瓶上贴有标签，用于辨识试样品。
优选的，对于上述所述的试剂盒，其中，所述盒盖四周设置有扣体，所述盒盖通过所述扣体与所述试剂盒本体扣合。
本实用新型的有益效果包括：
1.本实用新型提供的试剂盒采用数字PCR的方法检测IDH2的突变，针对突变涉及特异性优化的引物和探针，并辅以保守区的质检探针，调整试剂盒中DNA抽提的配方及浓度，提取浓度较高的DNA，方便后续检测，最终得到的试剂盒高效简洁，具有较高的灵敏度和特异性；
2.本实用新型的试剂盒用于检测IDH2突变的过程，优化数字PCR的检测流程，突变平均丰度较高，准确度达到100％，操作简单易行，耗时短，结果准，对癌症的预后及指导治疗有积极作用；
3.本实用新型采用所述的试剂盒，能够防止试剂污染，且使用方便快捷。
附图说明
图1是实施例一中的用于检测IDH2基因R172K突变试剂盒的示意图，其中，1-试剂盒本体，2-盒盖，3-第一容器，4-第二容器，7-缓冲垫，8-圆孔，31-引物1试管，32-引物2试管，33-第一探针试管，41-缓冲液的试管。
图2是实施例二中的用于检测IDH2基因R172K突变试剂盒的示意图，其中，1-试剂盒本体，2-盒盖，3-第一容器，4-第二容器，5-第三容器，7-缓冲垫，8-圆孔，31-引物1试管，32-引物2试管，33-第一探针试管，41-缓冲液试管，51-引物3试管，52-引物4试管，53-第二探针试管。
图3是实施例三中的用于检测IDH2基因R172K突变试剂盒的示意图，其中，1-试剂盒本体，2-盒盖，3-第一容器，4-第二容器，5-第三容器，6-第四容器，7-缓冲垫，8-圆孔，31-引物1试管，32-引物2试管，33-第一探针试管，41-缓冲液试管，51-引物3试管，52-引物4试管，53-第二探针试管，61-第一抽提试剂瓶，62-第二抽提试剂瓶，63-第三抽提试剂瓶，64-第四抽提试剂瓶，65-第五抽提试剂瓶，66-第六抽提试剂瓶，67-第七抽提试剂瓶。
图4为实施例五中IDH2基因R172K突变位点的微滴数目结果示意图，其中，从上到下依次为突变型游离DNA(阳性)微滴数、质控游离DNA微滴数以及无扩增的游离DNA(阴性)微滴数。
图5为实施例五的IDH2基因R172K的突变微滴频率分布图，其中，突变频率等于突变的DNA微滴数目除以总微滴数目，其从左到右分别代表阴性微滴、质控游离DNA微滴以及突阳性微滴。
具体实施方式
下面结合附图对本实用新型的用于检测IDH2基因R172K突变的试剂盒进行详细说明。
本实用新型提供了一种检测IDH2基因R172K突变的试剂盒，所述试剂盒包括数字PCR试剂，所述数字PCR试剂包括根据IDH2基因的R172K突变位点的多态性设计的引物和探针；
所述IDH2基因的R172K突变位点的引物1的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物2的核酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述第一探针的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述SEQ ID NO:1为ATTGGCAAACACGCCCATGGCGAC；
所述SEQ ID NO:2为GGTTCGGGTAGTGGTAACCG；
所述SEQ ID NO:3为CCATTGGCAGGCACGCCCAT。
优选的，所述第一探针带有5’端修饰的荧光基团和3’端修饰的淬灭基团，优选的，所述荧光基团选自于FAM、VIC或HEX中的一种，优选为FAM；
所述淬灭基团选自于BHQ1、BHQ2或MGB中的一种，优选为MGB；
优选的，所述试剂盒还包括根据IDH2基因的保守区设计的引物3、引物4和第二探针；
优选地，所述IDH2基因的保守区的3引物的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述IDH2基因的保守区的引物4的核酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述第二探针如SEQ ID NO:6所示；
所述SEQ ID NO:4为GCCCGTGTGGAAGAGTTCAA；
所述SEQ ID NO:5为TGTTCCGGATAGTTCCATTGG；
所述SEQ ID NO:6为CTGAAGAAGATGTGGAAAA。
优选地，所述第二探针带有5’端修饰的荧光基团和3’端修饰的淬灭基团；
优选地，所述荧光基团选自于FAM、VIC或HEX中的一种，优选为HEX；
优选地，所述淬灭基团选自于BHQ1、BHQ2或MGB中的一种，优选为MGB；
优选地，所述PCR试剂盒还包括2×ddPCR缓冲液。
优选的，所述引物1、引物2、引物3和引物4的浓度分别为0.2-1μM，例如可以是0.2μM、0.5μM、0.8μM或1μM。
优选的，所述探针的浓度为0.1-0.5μM，例如可以是0.1μM、0.3μM、0.4μM或0.5μM。
优选的，所述试剂盒还包括DNA抽提试剂，所述DNA抽提试剂包括红细胞裂解液、细胞核裂解液、EDTA、蛋白酶K、饱和酚、氯仿和乙醇。
人外周血中的淋巴细胞是抽提基因组DNA最方便的材料。DNA在细胞核内是与蛋白质形成复合物的形式存在，因此提取过程中必须将其中的蛋白质除去，SDS可将细胞膜、核膜破坏，并将组蛋白从DNA分子上分离，使核蛋白上的核酸游离。EDTA可抑制细胞中DNase活性。蛋白酶K可以用于消化细胞核膜以及核内蛋白质，RNase除去核酸中的RNA。再用苯酚氯仿抽提可进一步使蛋白质变性而与核酸分开，再经无水乙醇沉淀，最后可得到比较纯净的DNA。
优选地，所述蛋白酶K的浓度为18-22mg\/mL，例如可以是18mg\/mL、19mg\/mL、20mg\/mL、21mg\/mL或22mg\/mL，优选为20mg\/mL。
优选地，所述红细胞裂解液包括NH4<\/sub>Cl、KHCO3<\/sub>和EDTA。
优选地，所述细胞核裂解液包括pH 8.2的Tris-HCl、NaCl和EDTA。
优选地，所述NH4<\/sub>Cl的浓度为0.15-0.20M，例如可以是0.15M、0.155M、0.18M或0.20M，优选为0.155M。
优选地，所述红细胞裂解液的KHCO3<\/sub>的浓度为0.01-0.02M，例如可以是0.01M、0.015M或0.02M，优选为0.01M。
优选地，所述红细胞裂解液的EDTA的浓度为0.1-0.2M，例如可以是0.1M、0.15M或0.2M，优选为0.13M。
优选地，所述细胞核裂解液的Tris-HCl的浓度为0.01-0.02M，例如可以是0.01M、0.015M或0.02M，优选为0.01M。
优选地，所述细胞核裂解液的NaCl的浓度为0.3-0.5M，例如可以是0.3M、0.4M或0.5M，优选为0.4M。
优选地，所述细胞核裂解液的EDTA的浓度为0.005-0.01M，例如可以是0.005M、0.008M或0.01M，优选为0.008M。
本实用新型提供一种采用上述所述试剂盒检测IDH2突变的方法，包括如下步骤：
(1)抽提DNA：采用DNA抽提试剂提取外周血DNA；
(2)制备微滴：将步骤(1)抽提的DNA与数字PCR试剂盒混合，放入微滴发生器中制备微滴；
(3)PCR扩增：将步骤(2)制备的微滴封膜后按照设置程序进行PCR扩增；
(4)微滴检测：将步骤(3)反应后的PCR板转移至微滴分析仪中进行荧光检测，并使用软件进行浓度计算。
优选地，步骤(1)所述提取的DNA浓度≥30ng\/μL。
所述PCR的反应体系：9μL DNA约100ng和11μL探针引物、ddPCR缓冲液的混合液。
优选地，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min，随后94℃变性15s，60℃退火30s，进行40个循环，最后98℃延伸10min。
优选的，采用上述所述试剂盒检测IDH2突变的方法，具体步骤包括如下：
(1)抽提DNA：采用DNA抽提试剂提取外周血DNA，得到浓度≥30ng\/μL的DNA；
(2)制备微滴：将步骤(1)抽提的DNA与ddPCR试剂混合，放入微滴发生器中制备微滴；
(3)PCR扩增：将步骤(2)制备的微滴封膜后按照94℃预变性5min，随后94℃变性15s，60℃退火30s，进行40个循环，最后98℃延伸10min的步骤进行PCR扩增；
(4)微滴检测：将步骤(3)反应后的PCR板转移至微滴分析仪中进行荧光检测，并使用软件进行浓度计算。
实施例一第一种试剂盒
从图1可以看出，本实用新型的用于检测IDH2基因R172K突变的试剂盒，包括试剂盒本体1和盒盖2，所述盒2通过卡扣结构与所述试剂盒本体1扣合，所述试剂盒本体1中设置有缓冲垫7，所述缓冲垫上设置有用于容纳容器的圆孔8，所述试剂盒本体1中设置有第一容器3和第二容器4，
所述第一容器3中设置有引物1试管31、引物2试管32和第一探针试管33；所述引物1、引物2和第一探针是根据IDH2基因的R172K突变位点的多态性设计的，所述引物1的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，其为ATTGGCAAACACGCCCATGGCGAC，所述引物2的核酸序列如SEQID NO：2所示，其为：GGTTCGGGTAGTGGTAACCG，所述第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，其为：CCATTGGCAGGCACGCCCAT，所述第一探针带有5’端修饰的荧光基团和3’端修饰的淬灭基团，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB；
所述第二容器4中设置有缓冲液的试管41，所述缓冲液为2×ddPCR缓冲液(伯乐公司微滴数字PCR仪所对应的产品)。
实施例二第二种试剂盒
从图2可以看出，本实用新型的用于检测IDH2基因R172K突变的试剂盒，包括试剂盒本体1和盒盖2，所述盒2通过卡扣结构与所述试剂盒本体1扣合，所述试剂盒本体1中设置有缓冲垫7，所述缓冲垫上设置有用于容纳容器的圆孔8，所述试剂盒本体1中设置有第一容器3、第二容器4和第三容器5，
所述第一容器3中设置有引物1试管31、引物2试管32和第一探针试管33；所述引物1、引物2和第一探针是根据IDH2基因的R172K突变位点的多态性设计的，所述引物1的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，其为ATTGGCAAACACGCCCATGGCGAC，所述引物2的核酸序列如SEQID NO：2所示，其为：GGTTCGGGTAGTGGTAACCG，所述第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，其为：CCATTGGCAGGCACGCCCAT，所述第一探针带有5’端修饰的荧光基团和3’端修饰的淬灭基团，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB；
所述第二容器4中设置有缓冲液的试管41，所述缓冲液为2×ddPCR缓冲液；
所述第三容器(5)设置有引物3试管(51)、引物4试管(52)和第二探针试管(53)，所述引物3、引物4和第二探针是根据IDH2基因的保守区所设计的，所述引物3的核酸序列如SEQ ID NO：4所示，其为：GCCCGTGTGGAAGAGTTCAA，所述引物4的核酸序列如SEQ ID NO：5所示，其为：TGTTCCGGATAGTTCCATTGG，所述第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示，其为：CTGAAGAAGATGTGGAAAA，所述第二探针带有5’端修饰的荧光基团和3’端修饰的淬灭基团，所述荧光基团为HEX，所述淬灭基团为MGB。
实施例三第三种试剂盒
从图3可以看出，本实用新型的用于检测IDH2基因R172K突变的试剂盒，包括试剂盒本体1和盒盖2，所述盒2通过卡扣结构与所述试剂盒本体1扣合，所述试剂盒本体1中设置有缓冲垫7，所述缓冲垫上设置有用于容纳容器的圆孔8，所述试剂盒本体1中设置有第一容器3、第二容器4，第三容器5和第四容器6。
所述第一容器3中设置有引物1试管31、引物2试管32和第一探针试管33；所述引物1、引物2和第一探针是根据IDH2基因的R172K突变位点的多态性设计的，所述引物1的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，其为ATTGGCAAACACGCCCATGGCGAC，所述引物2的核酸序列如SEQID NO：2所示，其为：GGTTCGGGTAGTGGTAACCG，所述第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，其为：CCATTGGCAGGCACGCCCAT，所述第一探针带有5’端修饰的荧光基团和3’端修饰的淬灭基团，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB；
所述第二容器4中设置有缓冲液的试管41，所述缓冲液为2×ddPCR缓冲液；
所述第三容器(5)设置有引物3试管(51)、引物4试管(52)和第二探针试管(53)，所述引物3、引物4和第二探针是根据IDH2基因的保守区所设计的，所述引物3的核酸序列如SEQ ID NO：4所示，其为：GCCCGTGTGGAAGAGTTCAA，所述引物4的核酸序列如SEQ ID NO：5所示，其为：TGTTCCGGATAGTTCCATTGG，所述第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示，其为：CTGAAGAAGATGTGGAAAA，所述第二探针带有5’端修饰的荧光基团和3’端修饰的淬灭基团，所述荧光基团为HEX，所述淬灭基团为MGB；
所述第四容器6中设置有第一抽提试剂瓶61、第二抽提试剂瓶62、第三抽提试剂瓶63、第四抽提试剂瓶64、第五抽提试剂瓶65、第六抽提试剂瓶66和第七抽提试剂瓶67，所述第一试剂瓶中设置有红细胞裂解液，所述第二试剂瓶62中设置有细胞核裂解液，所述第三试剂瓶63中设置有EDTA，所述第四试剂瓶64中设置有蛋白酶K，所述第五试剂瓶65中设置有碱性饱和酚，第六试剂瓶66中设置有氯仿，所述第七试剂瓶67中设置有乙醇，上述抽提试剂瓶用于抽提DNA。
实施例四试剂盒的使用方法
为了使本实施例所提供的试剂盒更好地说明并便于解释本发明所获得的技术效果，现对第一种试剂盒的使用方法说明如下(第二种和第三种试剂盒的使用方法与第一种试剂盒的使用方法相同)：
(1)样本DNA的抽提：采用DNA抽提试剂提取外周血DNA，其具体操作方法如下：
A.取40mL的1×红细胞裂解液和采用了PI3K抑制剂等PI3K通路相关靶向药物治疗的人类癌症患者的4-6mL EDTA抗凝外周血于50mL离心管中混匀，直至溶液变透明，4℃2000rpm离心10分钟，小心去上清液，加3mL1×细胞核裂解液和25μL蛋白酶K于离心管中，振荡至匀，加300μL 20％SDS，摇匀至出现粘稠透明状，37℃消化6小时以上，得到消化液；
B.加6mL饱和酚于15mL离心管中，将消化液加入此离心管，轻摇混匀，4℃2000rpm离心10分钟，再加等体积酚\/氯仿(各3mL)至另一15mL离心管，小心将上清移至此离心管，混匀，4℃2000rpm离心10分钟；
C.加6mL氯仿于15mL离心管中，小心将上清液移至此离心管，混匀，4℃2000rpm离心10分钟；加10mL无水乙醇另一15mL离心管，小心将上清液移至此离心管摇匀，得到白色絮状DNA，用剪掉尖头的TIP将DNA吸出，12000rpm离心20分钟后，用70％乙醇洗二次(第一次500μL，第二次300μL，12000rpm离心10min)，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL1×TE缓冲液中，室温溶解过夜，然后紫外测OD值为1.561，从而获得体积为60μL且DNA浓度为78.05ng\/μL的DNA抽提物。
(2)制备微滴：取步骤(1)所得到的DNA约100ng，分别与11μL浓度均为10μM的第一容器中的引物、探针和第三容器中的缓冲液混合、第二容器中的引物、探针和第三容器中的缓冲液混合，分别得到PCR反应液；然后在DG8TM微滴发生卡上相对应的孔中分别加入20μL上述PCR反应液以及70μL微滴发生专用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QX200微滴发生器(美国Bio-rad伯乐公司)内进行反应；然后将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜；
(3)PCR扩增：将步骤(2)所得到的微滴按PCR扩增程序进行目的片段的扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min，随后94℃变性15s，60℃退火30s，进行40个循环，最后98℃延伸10min，4℃保存；
(4)微滴检测：PCR反应结束后，将PCR板转移到QX200微滴分析仪(Bio-RadLaboratories USA)上，对所有样品孔进行荧光检测。
实施例五临床样本检测结果
使用本实用新型的试剂盒，利用实施例二所述的使用方法，检测一例患者(天津市肿瘤医院)的外周血样品，所得到的检测结果使用QuantaSoftTM软件进行浓度计算，质控有扩增(在HEX荧光信号区域有微滴分布)的前提下存在突变型片段的扩增(在FAM荧光信号区域有微滴分布)，则判断该基因有突变，其结果如图4和图5所示，其中，图4中，从上到下依次为突变型游离DNA(阳性)微滴数、质控游离DNA微滴数以及无扩增的游离DNA(阴性)微滴数。
从图4可以看出，该患者的突变型片段的微滴数目大于10000，而根据统计学原理的理论，只有当微滴数目大于10000时，DNA分子的分布才能符合泊松分布的统计学原理，系统才能对阳性和阴性微滴进行计数，因此，符合检测要求，可以用于检测IDH2基因R172K的突变。
从图5可以看出，阴性峰和阳性峰显著分开，中间没有任何干扰，说明区分效果较好，扩增体系适合对IDH2基因R172K突变进行定量分析。
本实用新型采用上述的试剂盒对40例患者(来自于天津市肿瘤医院)的外周血样品进行检测，并用q-PCR检测进行对比，ddPCR检出28例突变，q-PCR检出24例突变，与q-PCR相比具有更高的灵敏度和特异性，并且对该40例患者的外周血样品进行检测，血液样本检测结果与组织检测一致，准确度达到100％，说明本实用新型的试剂盒对癌症的预后及指导治疗有积极的作用。
综上所述，本实用新型提供的试剂盒检测IDH2的突变，具有较高的灵敏度和特异性，并且优化了数字PCR的检测流程，突变平均丰度较高，准确度达到100％，操作简单易行，耗时短，结果准，对癌症的预后及指导治疗有积极作用。
以上所述仅为本实用新型较佳实施例，并不用于局限本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在实用新型的保护范围之内。
设计图
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申请码:申请号:CN201920003065.X
申请日:2019-01-02
公开号:公开日:国家:CN
国家/省市:12(天津)
授权编号:CN209778899U
授权时间:20191213
主分类号:C12Q1/6886
专利分类号:C12Q1/6886;C12Q1/686
范畴分类:18H;
申请人:天津医科大学第二医院
第一申请人:天津医科大学第二医院
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发明人:姜文华
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