利用biotin标记和变性免疫沉淀鉴定程序性坏死中RIP3磷酸化位点的新方法

论文摘要

细胞程序性坏死是一种由TNF-α诱导的、可调控的细胞死亡,因此与许多病理学和生理学过程有关。RIP3作为该坏死过程的关键蛋白,其相关研究一直都备受人们的关注。在程序性坏死发生的时候,RIP3被信号通路上游的蛋白RIP1所激活,这个过程中的一个指标就是RIP3的磷酸化。到目前为止,仅有一个RIP3的功能性磷酸化位点Ser227被发现。激活的坏死小体的尺寸较大,一般会存在于细胞裂解液的不可溶组分,因此在之前的研究中往往被忽略。为了揭示该部分的重要信息,我们尝试使用新方法获得并分析不可溶组分中的激活的坏死小体。利用Streptavidin-Biotin之间无法被强变性剂（SDS）破坏的抗体-抗原强结合力,我们采用变性免疫沉淀法替代传统的普通免疫沉淀法,富集特异性标记biotin的目标蛋白用于质谱分析。蛋白质特异性标记biotin的系统有两种:AVI-tag/BirA系统中的BirA会在AVI-RIP3的AVI-tag上标记,而APEX2-tag系统则通过酶促反应标记与RIP3空间上接近的蛋白。我们利用这两种方法分别成功地得到了RIP3潜在的磷酸化位点和与RIP3相关的候选蛋白质。本论文优化了不可溶组分中的蛋白质复合体富集和分析的实验方法,可以用于探究信号通路中以往因为不可溶性而被忽略的大型蛋白质复合体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 RIP3相关的程序性细胞坏死
•   1.2 肿瘤坏死因子-α（TNF-α,Tumor necrosis factor-α）
•   1.3 由TNF-α诱导且与RIP3相关的程序性细胞坏死
•   1.4 RIP3相关的程序性细胞坏死的相关蛋白
•     1.4.1 RIP1
•     1.4.2 RIP3
•     1.4.3 MLKL
•   1.5 蛋白质复合体及其提纯方法
•   1.6 免疫（共）沉淀
•     1.6.1 非变性状态下的免疫（共）沉淀
•     1.6.2 变性状态下的免疫（共）沉淀
•   1.7 特异性biotin标记蛋白的方法
•     1.7.1 AVI-tag系统介导的biotin标记
•     1.7.2 APEX2-tag系统介导的biotin标记
•   1.8 质谱
•   1.9 立题背景
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料与试剂
•     2.1.1 分子克隆相关实验所需材料
•     2.1.2 细胞相关实验所需材料
•     2.1.3 蛋白质分析相关实验所需试剂
•   2.2 实验容器和仪器
•     2.2.1 分子克隆相关实验所需容器和仪器
•     2.2.2 细胞相关实验所需容器和仪器
•     2.2.3 蛋白质分析相关实验所需容器和仪器
•     2.2.4 成像相关实验所需仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 分子克隆相关的实验方法
•     2.3.2 细胞相关实验方法
•     2.3.3 蛋白质分析相关实验方法
•     2.3.4 成像相关实验方法
• 第三章 实验结果与分析
•   3.1 大部分激活的RIP3进入不可溶组分
•     3.1.1 激活的RIP3以磷酸化形式存在且大部分在细胞裂解液中是不可溶的
•     3.1.2 程序性坏死会使RIP1/RIP3/MLKL共定位并形成较大的复合物
•   3.2 降低离心速率能释放更多激活的RIP3到可溶性组分中
•     3.2.1 低离心速率有利于得到更多RIP3用于IP
•     3.2.2 用注射器辅助吹散细胞团块使细胞裂解更充分并释放更多蛋白
•     3.2.3 从不可溶组分中释放更多磷酸化RIP3的同时会带来更多的杂质影响
•   3.3 利用AVI-tag系统进行变性IP鉴定RIP3磷酸化位点
•     3.3.1 除了S227外RIP3有其他磷酸化位点
•     3.3.2 AVI-tag介导的biotin标记蛋白可用于变性IP
•     3.3.3 与普通IP一样变性IP依旧需要PIC
•     3.3.4 SDS用于变性IP的蛋白洗脱是比较高效的
•     3.3.5 TCA沉淀蛋白有效但在沉淀RIP3时是低效的
•     3.3.6 Trizol沉淀蛋白的效率比TCA更差
•     3.3.7 SDC洗脱蛋白比SDS洗脱蛋白加TCA沉淀蛋白的组合最终的蛋白得率更高
•     3.3.8 AVI介导的RIP3磷酸化位点质谱鉴定和分析
•   3.4 利用APEX2-tag系统进行变性IP拉取RIP3以及与其相互作用蛋白
•     3.4.1 APEX2-tag系统介导的biotin标记蛋白有着准确的空间精确性且可用于变性IP
•     3.4.2 APEX2-tag系统介导的biotin标记RIP3及其相互作用蛋白是可行的
•     3.4.3 APEX2-tag系统介导的RIP3相互作用蛋白质谱鉴定和分析
• 第四章 总结与讨论
• 附录1 图表索引
• 附录2 缩略语及中英文对照
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 汪馨

导师: 韩家淮

关键词: 程序性细胞坏死,磷酸化,变性免疫沉淀

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q25

总页数: 82

文件大小: 5497K

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