（1浙江大学医学院附属儿童医院浙江杭州310052）
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【摘要】目的：单羰基姜黄素类似物31的抗炎活性及其机制探讨。方法：采用脂多糖刺激小鼠巨噬细胞构建体外炎症模型，在蛋白层面用酶联免疫吸附实验检测31对LPS诱导的炎症因子IL-6及TNF-α的分泌的抑制作用，紫外光谱实验检测化合物的稳定性，WesternBlot法检测化合物31对丝裂原活化蛋白激酶通路蛋白磷酸化及NF-κB通路IκB降解的影响。结果：姜黄素类似物31能剂量依赖性地抑制LPS诱导的炎症因子释放并有效抑制ERK及JNK的磷酸化。结论：姜黄素类似物31能够通过ERK和JNK信号通路发挥抗炎活性。
【关键词】姜黄素；炎症；脂多糖；酶联免疫吸附实验；巨噬细胞
【中图分类号】R962【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）19-0359-03
巨噬细胞在体内广泛分布，研究表明多种炎性疾病的发生发展与巨噬细胞及其释放的炎症介质有密切的联系[1]。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成份，在LPS的诱导下，激活的巨噬细胞能够释放大量的炎症介质及细胞因子[2]。其中IL-6及TNF-α被认为是重要的促炎介质，研究表明他们在多种急性及慢性炎症疾病中扮演着重要角色[3,4]。抑制IL-6及TNF-α从而治疗脓毒血症、糖尿病并发症、肿瘤及类风湿性关节炎已经成功进入临床前期或临床研究[5]。因此，抑制激活的巨噬细胞的炎症细胞因子的释放是一种重要的抗炎药物作用形式，也成为了当前药物研发的重点。
姜黄素(图1A)是从姜科植物姜黄、郁金、莪术的干燥根茎中提取的一种天然有效成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等广泛的药理作用[6]。体内外实验均表明，姜黄素能通过抑制炎症因子如IL-6、TNF-α的释放从而减轻炎症[7]。由于其结构不稳定和生物利用度低等缺点严重限制了其临床应用[8]。相比于姜黄素，不含有β-二酮基团的单羰基姜黄素类似物（MACs）显示出更强的生物稳定性及生物活性[8][9]。在本实验中将采用前期发现的具有抗肿瘤活性的单羰基姜黄素类似物31（图1B）来研究其是否具有除抗肿瘤活性外的其他活性[10]，并且初步探讨其抗炎机制。
图1姜黄素及其类似物31的化学结构
1.主要试剂与仪器
LPS（Sigma，美国）；RPMI1640培养基（Gibco，德国）；胎牛血清（Gibco，德国）；细胞用DMSO（北京索莱宝科技有限公司，中国）；小鼠TNF-αELISA试剂盒（eBioscience，美国）；小鼠IL-6ELISA试剂盒（eBioscience，美国）；GAPDH抗体（SantaCruz，美国）；P-JNK抗体（CellSignalingTechnology，美国）；JNK抗体（CellSignalingTechnology，美国）；P-P38抗体（CellSignalingTechnology，美国）；P38抗体（CellSignalingTechnology，美国）；P-ERK抗体（SantaCruz，美国），ERK抗体（SantaCruz，美国），IκB抗体（SantaCruz，美国）。
CO2细胞培养箱（Thermo，美国）；酶标仪（SpectramaxM5，美国）；低温离心机（Thermo，美国）；电泳仪及转膜仪（Bio-Rad，美国）；曝光仪（Bio-Rad，美国）；RT-qPCR仪（Bio-rad，美国）；凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）。
2.实验方法
2.1ELISA法检测细胞培养基中IL-6和TNF-α的分泌
体外培养RAW264.7巨噬细胞，在37℃和5%CO2培养箱下孵育24小时后更换培养基，加入10μM的姜黄素和不同剂量（2.5，5和10μM）的化合物31孵育细胞30分钟后，再加入0.5μg/mL的LPS继续孵育细胞24小时后，收取细胞培养基，用ELISA法检测培养基中的IL-6和TNF-α的含量，各指标测定方法参照ELISA试剂盒说明书，并且用同一培养皿中的细胞总蛋白浓度进行定量。
2.2细胞毒性试验
体外培养RAW264.7巨噬细胞，在37℃和5%CO2培养箱下孵育24小时后，更换培养基，加入不同浓度（2.5，5，10和20μM）的活性化合物31孵育细胞24小时后，加入MTT孵育细胞4小时后，用酶标仪在490nm处测其吸光度。
2.3稳定性实验
用DMSO将姜黄素及化合物31配成1mM的母液，然后用PBS（pH7.4）稀释到20μM，取100μL加入到比色皿中，用酶标仪在37℃、250～600nm波长处扫描化合物的紫外吸光值，总共检测25min，每隔5min检测一次。
2.4Westernblot实验
体外培养RAW264.7巨噬细胞，在37℃和5%CO2培养箱下孵育24小时后，更换培养基，加入不同浓度（2.5、5、10和20μM）的化合物31孵育细胞30分钟后，再加入0.5μg/mL的LPS继续孵育细胞30min后，收集细胞总蛋白，用WesternBlot实验检测ERK、P38和JNK的磷酸化以及IκBα的降解。
2.5统计学方法
以上数据用均值的标准误差表示（Mean±SEM），所有的数据用GraphPadPrism5.0进行作图，Student’st-test用于做统计学分析，P<0.05认为有统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
3.实验结果
3.1化合物31的细胞毒性
从图2可以看出不同浓度的化合物31孵育细胞24小时后，对RAW264.7的存活率没有明显的影响，在最大浓度20μM时也没有表现出明显的细胞毒性。
3.4化合物31的抗炎机制
进一步探讨化合物31的抗炎机制，从图4可以看出与阴性对照组相比，LPS孵育细胞30min后能明显的增加ERK（图4A）、P38（图4B）和JNK（图4C）的磷酸化水平，而预孵育化合物31后能剂量依赖性地抑制ERK和JNK的磷酸化，但对p-P38的水平没有影响。这些数据表明化合物31有可能是通过抑制ERK和JNK的磷酸化发挥抗炎活性。NF-κB信号通路是LPS作用于细胞后被激活的另外一条经典的信号通路[11]，如图4D所示，LPS刺激后能明显的诱导IκBα的降解，但是预孵育化合物31后并不能逆转LPS诱导的IκBα降解，这个数据说明化合物31并非通过NF-κB信号通路发挥其抗炎活性。
图4化合物31对ERK、P38和JNK的磷酸化以及IκBα降解的影响
4.讨论
脂多糖LPS作用于细胞后，在LPS辅助蛋白和CD14的辅助下启动TLR4信号通路，激活下游的MAPK和NF-κB信号通路，促进炎症基因的转录释放炎症因子[12]。炎症因子的过度释放导致多种疾病的发生发展包括急性的脓毒血症和急性肺损伤以及慢性的动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、糖尿病和肥胖等[13]。目前临床上除了抗生素，尚缺乏有效的抗炎药物。姜黄素是一个多靶点的化合物，在过去的研究中发现姜黄素能够靶向抑制MAPK或者NF-κB发挥抗炎活性，从而缓解各种炎症性疾病[14,15]。在本研究中，姜黄素类似物31仅能够显著抑制ERK和JNK的磷酸化，但是对P38的磷酸化以及NF-κB信号通路的激活没有抑制活性，这说明化合物31虽然是姜黄素的类似物，但是他们发挥抗炎活性的机制是不同的。
在之前的研究中发现单羰基姜黄素类似物31具有很强的抗肿瘤活性[10]，在我们目前的研究中化合物31又表现出显著的抗炎活性，说明姜黄素类似物与其先导物一样具有多种药理学活性。在体外pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，化合物31表现出比姜黄素更强的稳定性，这说明化合物31具有比姜黄素更好的成药性。但是本研究尚未阐明姜黄素类似物31的抗炎靶点以及在动物体内的效果，在以后的研究中仍有待深入研究。
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