1.东营市广饶县人民医院山东/东营257300；2.青岛大学医学院附属医院山东/青岛266000
摘要：目的：探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂对大鼠脑缺血再灌注后脑组织基质金属蛋白酶-９（MMP-9）蛋白表达的影响。方法：90只雄性SD大鼠，随机分为假手术组、缺血再灌注组和抑制剂组。采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。再灌注24h后对大鼠进行神经功能缺损评分；采用免疫组化方法检测缺血周边区脑组织批p38MAPK、MMP-9的表达。结果与假手术组相比，缺血再灌注组和抑制剂组大鼠神经功能缺损加重（P<0.05）；缺血再灌注组大鼠缺血周边区脑组织p38MAPK、MMP-9的表达明显高于假手术组（均P<0.05）；，抑制剂组大鼠缺血周边区脑组织p38MAPK、MMP-9的表达低于缺血再灌注组（均P<0.05）。结论p38MAPK抑制剂可能导致大鼠脑缺血再灌注后周边区脑组织MMP-9的表达减少，提示其具有一定的脑保护作用。
关键词：脑缺血；丝裂原活化蛋白激酶；基质金属蛋白酶-９
缺血再灌注损伤是一个复杂的、多因素参与的过程，血脑屏障（BBB）的完整性在脑缺血再灌注损伤的病理生理过程中起着重要的作用，缺血后再灌注将导致
BBB严重破坏，从而促发明显的脑水肿[1]。研究表明使用尿激酶溶栓后可以增加大鼠脑梗死后基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表达[2]。目前关于p38MAPK通道在脑缺血再灌注损伤中机制尚不是很明确，本研究拟观察p38MAPK抑制剂SB203580对大鼠脑缺血再灌注后批p38MAPK、MMP-9蛋白的表达，探讨其作用的机制。
1材料与方法
1.1实验动物与试剂
本实验所用的大鼠购置于青岛市药物检验所实验动物中心（scxk鲁20130001），购买的大鼠要求为清洁级、体重200-250g、雄性SD大鼠，共90只。实验前大鼠在实验室自由饮水进食3天，以利于其适应环境。TTC购自Sigma公司，免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗体、P-P38多克隆抗体及MMP-9抗体（SantaCruz）。羊抗兔lgG（北京中杉金桥）。p38特异性抑制剂（SB203580）购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2方法
（1）线栓制备：鱼线购于北京沙东生物工程有限公司，直径为0.26mm；将鱼线切成4cm的小段，在其一端开始5、16、18、20mm处用记号笔标记以利术中观察，将鱼线断端用砂布打磨，尽量打磨成圆头，然后将石蜡融化，把鱼线打磨端约5mm长度插入融化的石蜡，不要在石蜡中放置过长时间，尽量3秒内拿出，自然晾干，挑选蜡端光滑均匀的鱼线在常温下保存备用。（2）石蜡切片的制备：假手术组、缺血再灌注组和抑制剂组各取10只大鼠。大鼠到达处死时间点后取材制备石蜡切片。腹腔注射麻醉（10%水合氯酸），将大鼠仰卧固定，然后打开胸腔、暴露心脏，心尖穿刺进入左心室（普通输液器即可），将右心耳剪开，快速灌注生理盐水约250mL，当右心耳流出清亮液体、肝脏与肺脏变白时，进行灌注固定（40g/L多聚甲醛），当大鼠身体僵硬后，断头取脑，将大脑放入40g/L多聚甲醛溶液固定，取前囟后3-6mn间冠状脑组织，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。石蜡切片机连续冠状位切片（在视交叉后开始搜集脑切片），厚度5m，平铺在多聚赖氨酸处理过的载玻片上，4℃保存备用。（3）免疫组化方法检测p38MAPK、MMP-9蛋白
1.3统计学处理
各组数据采用均值±标准差表示，利用SPSS21.0软件包进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（`x±s）表示，神经功能缺损评分比较采用秩和检验，组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1各组神经功能评分
三组神经功能评分比较有显著性差异（F=126.11p=0.000），与对照组相比，缺血再灌注组组和抑制剂组出现不同程度的神经功能缺失，差异有统计学意义（q=21.01，17.40；P<0.05）；抑制剂组神经功能评分较缺血再灌注组减少，差异有统计学意义（q=3.62，P<0.05）。
*P<0.05
2.2p38MAPK、MMP-9蛋白的表达
免疫组化结果显示，三组p38MAPK蛋白表达有显著性差异（F=117.29，p=0.000），缺血再灌注组和抑制剂组p38MAPK蛋白的表达数量明显多于对照组，差异有统计学意义（q=20.71，15.84；P<0.05）；与缺血再灌注组相比，抑制剂组P38MAPK蛋白的表达数量明显少，差异有统计学意义（q=4.87，P<0.05）。
三组MMP-9蛋白表达有显著性差异（F=23.48，p=0.000），缺血再灌注组和抑制剂组MMP-9蛋白的表达数量明显多于对照组，差异有统计学意义（q=9.57，6.13；P<0.05）；与缺血再灌注组相比，抑制剂组MMP-9蛋白的表达数量明显少，差异有统计学意义（q=3.44，P<0.05）。
A：对照组B：缺血再灌注组C：抑制剂组
3.讨论
大量的研究证实MAPK通路是脑缺血损伤过程的重要信号系统，p38是MAPK通路的关键蛋白之一，主要参与脑缺血以后的炎症反应、细胞增殖分化、氧化应激等过程[3]。苏木素-伊红染色可见缺血再灌注组肾小管上皮细胞有不同程度的片状坏死灶和炎性细胞侵润，使用FK506后，肾组织p38MAPK蛋白水平显著低于缺血再灌注组，并且肾组织损伤明显减轻。
本研究显示，与缺血再灌注组相比，抑制剂组p38MAPK、MMP-9蛋白表达明显减低。与目前的临床研究相一致.综上所述，阻断p38MAPK通路在大鼠缺血再灌注中的过度激活，可以下调MMP-9的过表达，减轻血脑屏障的损伤，减轻急性脑梗死脑水肿的发生，提示p38MAPK信号通路可能通过MMP-9的表达致血脑屏障的损伤，加重缺血再灌注后脑水肿的发生。本研究结果为治疗缺血再灌注后脑水肿提供了新思路，这仅仅是p38MAPK信号通路致脑水肿的一个机制之一，还需要进一步研究探索。
参考文献：
[1]YANGGY，LORRISA．ReperfusioninducedinjurytotheBloodbrainBarrieraftermiddlecerebralarteryocclusioninrats[J].Stroke，1994，25：1658-1665.
[2]SongY；ZouH；WangG；etal.Matrixmetalloproteinase-9andtissueinhibitorofmetalloproteinase-1expressioninearlyfocalcerebralinfarctionfollowingurokinasethrombolysisinrats[J].NeuralRegenRes，2012，7：1325-1330.
[3]王晓静，吴华璞，李子广，等.姜黄素抗脑缺血再灌注损伤作用与MAPK信号通路的相关性分析[J].中西医结合心脑血管病杂志，2010，8（6）：711-713.
作者简介：杜子强.性别：男民族：汉出生年月：1982年08月籍贯：中国山东东营广饶学科方向：脑血管。
作者简介：宋玉强（1970年5月），男，山东东营人，研究生，主任医师，主要从事脑血管病的临床科研和教学工作。