尿嘧啶-DNA糖基化酶的荧光传感新方法

论文摘要

尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil-DNA glycosylase,UDG）是一种重要的碱基切除修复（BER）的起始酶,可以修复脱氧尿嘧啶（dU）引发的DNA损伤从而维持基因组的完整性。异常的UDG活性与多种人类疾病的发生和发展密切相关,例如人类免疫缺陷,神经退行性疾病,淋巴瘤和癌症等,UDG也因而成为医学诊断以及治疗一些复杂疾病的重要靶标。开发用于检测UDG活性的灵敏方法对于基础生物医学研究和药物发现都是非常必要的,但UDG检测的常规方法通常耗时耗力且灵敏度较差。本论文中,我们基于一些简单、高效的核酸扩增技术及荧光检测手段,提出了两种针对UDG酶活性的新型荧光检测方法。主要内容如下:一、基于荧光共振能量转移机制的UDG活性分析基于阳离子共轭聚合物 PFP（poly[（9,9-bis（6’-N,N,N-triethy-lammonium）hexyl））fluorenylene phenylene dibromide])的荧光共振能量转移（FRET）特性,并结合UDG诱导的限制性核酸内切酶IV（Endo IV）的切割反应,在论文的第二章中我们设计了一种均相的、简单灵敏的、非核酸扩增方法定量检测UDG的活性。当把一条茎部含有4个脱氧尿嘧啶（dU）环部为5个胸腺嘧啶（T）的发夹结构的底物DNA和Endo IV一起温育时,由于dU不会受到影响,发夹结构将保持不变。这时加入嵌入型双链特异性荧光染料SYBR Green I（SGI）以及荧光共轭聚合物PFP作为荧光共振能量转移对,将会发生从PFP到SG I的FRET现象。而当体系中有UDG存在时,由于dU被UDG移除,进而Endo IV切割脱碱基位点（AP位点,AP site）生成单链DNA,SGI不能与之结合,导致FRET不能有效进行。因此,根据FRET效率和UDG的活性之间的反比关系,进而实现对UDG的定量检测。二、基于末端脱氧核苷酸转移酶辅助形成荧光铜纳米簇的UDG活性的高灵敏度分析在第三章中,我们提出了一个基于末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和脱氧胸苷三磷酸（dTTP）的核酸扩增方法,以荧光铜纳米簇（CuNCs）作为传感元件实现对UDG的高灵敏度测定。在该研究中,合理设计含有脱氧尿嘧啶的发夹结构DNA作为UDG的底物,其3’末端被2’,3’-双脱氧胞嘧啶（ddC）封闭。UDG可以特异性地移除DNA底物中的尿嘧啶碱基产生脱碱基位点,然后可以通过Enod IV切割该位点以暴露3’-OH末端。TdT将沿暴露的3’-OH末端启动无模板DNA延伸反应,以产生相当长的poly（T）尾,这将作为产生荧光CuNCs的完美模板。通过记录CuNCs的荧光信号,可以如实地反映UDG的活性。相反,如果不存在UDG,则DNA底物的3’-ddC末端不能被TdT识别,因此不会发生基于TdT的延伸反应和CuNCs的形成。使用ddC作为3’-末端封闭基团可以大大减少非特异性DNA延伸并改善信噪比。此外,TdT是一种无模板的、非序列依赖型的DNA聚合酶,可以高效地催化加尾过程,最多可形成数千个碱基长度的poly（T）序列,并且每条poly（T）可以形成许多荧光CuNCs,因此,实现了高灵敏度。此外,在TdT介导的延伸期间,通过引入一条含脱碱基位点的poly（A）寡核苷酸,还初步设计了支化扩增机制,可进一步降低UDG活性的检出限。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
•   1.1 选题背景与意义
•   1.2 UDG检测技术进展
•     1.2.1 传统检测方法
•     1.2.2 基于功能核酸探针的新型检测方法
•       1.2.2.1 基于发夹结构DNA探针的非核酸扩增检测方法
•       1.2.2.2 基于双链DNA探针的非核酸扩增检测方法
•       1.2.2.3 基于滚环扩增技术辅助的检测方法
•       1.2.2.4 基于杂交链式反应辅助的检测方法
•       1.2.2.5 基于链替代扩增策略的检测方法
•       1.2.2.6 基于催化发夹组装策略的检测方法
•       1.2.2.7 基于环介导等温扩增技术的检测方法
•       1.2.2.8 基于级联信号放大策略的检测方法
•       1.2.2.9 其它扩增方法
•   1.3 论文选题思想与主要内容
• 第二章 基于荧光共振能量转移机制的尿嘧啶-DNA糖基化酶的活性分析
•   2.1 前言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 仪器、试剂
•     2.2.3 实验步骤
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 原理
•     2.3.2 可行性研究
•     2.3.3 DNA浓度的确定
•     2.3.4 UDG活性分析
•   2.4 本章小结
• 第三章 基于末端转移酶和荧光铜纳米簇的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的高灵敏度分析
•   3.1 前言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 仪器与试剂
•     3.2.2 实验操作
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 原理
•     3.3.2 可行性研究
•     3.3.3 底物末端封闭类型对检测的影响
•     3.3.4 实验条件的优化
•     3.3.5 基于末端延伸反应的UDG活性分析
•     3.3.6 细胞提取物中UDG活性的测定
•   3.4 超支化TdT延伸机制检测UDG活性
•   3.5 本章小结
• 结束语
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘贵荣

导师: 刘成辉

关键词: 荧光,尿嘧啶糖基化酶,核酸内切酶,铜纳米簇,末端脱氧核苷酸转移酶

来源: 陕西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,化学

单位: 陕西师范大学

分类号: Q75;O657.3

DOI: 10.27292/d.cnki.gsxfu.2019.000696

总页数: 67

文件大小: 4985K

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