白氏文昌鱼TAK1基因的进化及免疫功能研究

论文摘要

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内,在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内,并引起细胞生物学反应,如细胞增殖、分化、转化及凋亡等的过程中具有至关重要的作用。TAK1（Transforming growth factor-βactivated kinase-1）,又名MAP3K7,作为丝裂源激活蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族的一员,是MAP3K家族唯一需要接头蛋白TAB1、2、3的帮助,从而起到激活作用的激酶,能够通过激活NF-KB、JNK及p38等通路,来参与免疫应答反应。文昌鱼作为从无脊椎动物进化到脊椎动物过渡类型的典型代表,成为整个生物进化史上一个不可缺少的“桥梁”,被誉为“活化石”。文昌鱼具有复杂的先天免疫系统,同时已有适应性免疫的雏形,对揭示脊椎动物免疫的起源具有重要意义。本论文以白氏文昌鱼TAK1为研究对象,对TAK1基因进行克隆,利用生物信息学方法对其结构及系统发生关系等进行分析,同时采用qPCR、CoIP等方法进一步分析TAK1基因的生物学功能,得到以下实验结果:（1）利用RT-PCR、RACE及End-to-End实验技术扩增获得白氏文昌鱼TAK1基因全长序列。TAK1基因全长为3527bp,其中TAK1-ORF序列长度为1905bp,编码634个氨基酸。（2）生物信息分析的结果表明:序列比对及相似性分析显示白氏文昌鱼TAK1蛋白序列与其它物种的同源蛋白序列具有较高的相似性;基因结构分析显示文昌鱼TAK1基因的编码区由18个外显子和17个内含子组成;保守结构域分析显示白氏文昌鱼TAK1基因包含一个保守的STKc结构域;系统发生树分析结果表明,白氏文昌鱼TAK1位于无脊椎动物和脊椎动物之间,与经典的物种进化地位一致;进一步的三维结构分析显示文昌鱼与人类的TAK1蛋白在三维结构上具有较高的相似性。（3）对文昌鱼TAK1基因的组织表达模式分析显示,TAK1基因在所检测的组织,包括性腺、鳃、肝盲囊、肠、肌肉及脊索中均有表达,其中在脊索和性腺中表达水平相对较高,而在肌肉和肠中的表达量相对较低。对LPS刺激白氏文昌鱼后不同时间点（2h,4h,6h,8h,12h,24h和48h）TAK1基因的表达量分析结果显示在文昌鱼用LPS刺激2h,12h后TAK1基因的表达量存在显著上调,在刺激24h后TAK1基因的表达量逐渐降低。（4）利用DNA重组技术构建了P3X-FLAG-TAK1表达载体,通过真核表达实验,成功表达出大小为68KDa的特异性蛋白,进一步利用Anti-FLAG tag抗体采用Western blot方法初步验证该特异蛋白为重组表达的TAK1蛋白。为了进一步探索文昌鱼中TAK1蛋白是否与高等物种中一致通过与TAB1互作来发挥功能,我们共转染了P3X-FLAG-TAK1和PCDNA3.1-Myc-TAB1重组质粒表达载体,通过CoIP分析结果显示,文昌鱼的TAK1蛋白与TAB1蛋白之间存在互作关系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 文昌鱼概况
•     1.1.1 文昌鱼的研究历史
•     1.1.2 文昌鱼的身体构造
•     1.1.3 文昌鱼生活习性
•     1.1.4 文昌鱼胚胎发育的研究
•     1.1.5 文昌鱼免疫系统的研究
•     1.1.6 文昌鱼的学术地位
•   1.2 TAK1 的研究概述
•     1.2.1 MAPK家族研究进展
•     1.2.2 TAK1 的研究进展
•     1.2.3 TAK1和TAB1 互作研究
•   1.3 论文研究的目的及意义
•   1.4 技术路线
• 第二章 白氏文昌鱼TAK1 基因的克隆
•   2.1 实验试剂、材料、与仪器
•     2.1.1 白氏文昌鱼的捕获与喂养
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 白氏文昌鱼TAK1 基因c DNA全长克隆
•       2.2.1.1 Trizol法提取白氏文昌鱼总RNA
•       2.2.1.2 文昌鱼 RNA 反转录合成 c DNA 模板
•       2.2.1.3 白氏文昌鱼TAK1 基因编码区PCR扩增中间片段
•       2.2.1.4 使用5’RACE技术扩增TAK1 基因的5’末端
•       2.2.1.5 使用3’RACE技术扩增TAK1 基因的3’末端
•       2.2.1.6 TAK1 基因End-to-End PCR扩增
•     2.2.2 免疫共沉淀
•     2.2.3 白氏文昌鱼TAK1和TAB1 蛋白免疫共沉淀表达
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 采取Trizol法提取法获取白氏文昌鱼总RNA
•     2.3.2 白氏文昌鱼TAK1 基因编码区序列扩增
•     2.3.3 构建TAK1和TAB1 基因的表达载体
•     2.3.4 TAB1和TAK1 蛋白免疫共沉淀
•   2.4 讨论
• 第三章 白氏文昌鱼TAK1 基因的生物信息学分析
•   3.1 实验分析软件与方法
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 分析文昌鱼TAK1 的基因结构
•     3.2.2 TAK1 蛋白结构域保守性和同源性分析
•     3.2.3 白氏文昌鱼TAK1 基因的进化性分析
•     3.2.4 白氏文昌鱼TAK1 蛋白三级结构分析
•   3.3 讨论
• 第四章 白氏文昌鱼TAK1 基因抗菌功能的研究
•   4.1 实验材料与仪器
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 实验仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 白氏文昌鱼被LPS刺激后TAK1 基因表达量的变化
•     4.2.2 各组织中TAK1 基因表达量的变化
•     4.2.3 实验结果的数据整理及分析
•   4.3 实验结果与分析
•     4.3.1 白氏文昌鱼被LPS刺激后TAK1 基因表达量的变化情况分析
•     4.3.2 各组织中TAK1 基因表达量的变化
•   4.4 讨论
• 总结
• 附录
•   附表1 文昌鱼TAK1基因PCR引物序列
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 彭双莉

导师: 马飞

关键词: 白氏文昌鱼,基因,进化,先天免疫

来源: 南京师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南京师范大学

分类号: Q953

DOI: 10.27245/d.cnki.gnjsu.2019.001039

总页数: 61

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