玉米Dek44基因遗传定位与功能分析

论文摘要

玉米是我国重要的粮食作物之一,其籽粒不仅是重要的生殖器官,而且是产量形成的基础。研究玉米籽粒发育的机制对提高玉米产量和改良籽粒品质具有重要的意义。本研究以EMS诱变的玉米籽粒发育突变体defective kernel 44（dek44）为材料。dek44突变体的突变型籽粒变小,颜色变浅呈灰白色,百粒重显著降低。通过对不同发育时期籽粒的组织切片进行观察,发现突变型籽粒的胚和胚乳发育明显迟滞于同时期野生型,胚乳中淀粉积累减少。遗传统计分析表明该突变体表型受隐性单位点控制。首先,我们利用图位克隆技术将候选基因定位于5号染色体上,然后通过扩大群体和开发新的分子标记将目的基因定位在1.29 Mb大小的区间内,最后对区间内基因测序,发现Zm00001d014471基因的外显子上存在C到T的突变,该突变造成第150个氨基酸由丝氨酸变为苯丙氨酸,因此我们将其命名为Dek44。Dek44基因编码一个含有10个PPR-motif的E类PPR蛋白。由于该类型蛋白主要参与RNA的编辑过程,因此我们对编码线粒体复合物的35个线粒体基因的转录本的RNA编辑效率进行检测。结果发现,rps13转录本中第56位碱基的C到U的RNA编辑几乎完全丧失,nad9转录本中第14、92、190、356四个位点的RNA编辑效率下降达50%。同时,我们对35个基因的转录本进行半定量分析,发现nad1和nad4的转录本丰度显著降低,暗示这两个基因的内含子剪切可能受到影响。进一步分析表明nad1intron1、nad1 intron4和nad4 intron1的剪切受到严重影响。我们通过实时荧光定量PCR检测了玉米线粒体基因组中22个II型内含子的剪切效率,结果与半定量分析的结果一致。nad1,nad4和nad9是编码线粒体复合物Ⅰ亚基的基因,三者的加工异常可能会影响复合物I的功能。于是我们通过蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis,BN-PAGE）发现线粒体呼吸链复合物Ⅰ和超级复合物（I+III2）的丰度显著降低,分析其活性发现复合物I和超级复合物（I+III2）的活性显著降低。qRT-PCR显示交替氧化酶基因（Aoxs）尤其是Aox2基因的表达水平显著升高。综上所述,dek44突变体中线粒体转录本的RNA编辑和内含子剪切受到严重影响,造成线粒体功能受损,影响了籽粒的正常发育。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 玉米概述
•     1.1.1 玉米的起源和传播
•     1.1.2 玉米籽粒发育
•     1.1.3 玉米胚的发育
•     1.1.4 玉米胚乳发育
•     1.1.5 玉米dek籽粒突变体
•   1.2 线粒体
•     1.2.1 线粒体与电子传递链
•     1.2.2 线粒体电子传递链复合物
•     1.2.3 线粒体是半自主细胞器
•   1.3 PPR蛋白
•     1.3.1 PPR蛋白的分类
•     1.3.2 PPR蛋白的功能
•       1.3.2.1 P类 PPR蛋白与RNA
•       1.3.2.2 PLS类 PPR蛋白与RNA
•   1.4 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 玉米材料
•     2.1.2 菌株及质粒载体
•     2.1.3 酶与生化试剂
•     2.1.4 引物合成和DNA测序
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 材料种植及生长环境
•     2.2.2 表型观察
•     2.2.3 石蜡切片观察
•     2.2.4 玉米基因组DNA提取方法
•     2.2.5 PCR筛选多态性SSR分子标记
•     2.2.6 PCR产物检测
•       2.2.6.1 50 ×TAE电泳母液配制
•       2.2.6.2 5 %琼脂糖凝胶的配制及PCR产物的检测
•     2.2.7 SSR分子标记的开发
•     2.2.8 PCR扩增候选基因
•     2.2.9 琼脂糖凝胶回收
•     2.2.10 连接反应
•     2.2.11 大肠杆菌感受态细胞的制备与遗传转化
•       2.2.11.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
•       2.2.11.2 大肠杆菌感受态细胞的转化
•     2.2.12 大肠杆菌菌落PCR鉴定
•     2.2.13 DNA测序
•     2.2.14 总RNA提取
•       2.2.14.1 玉米籽粒RNA提取
•       2.2.14.2 玉米组织RNA提取
•     2.2.15 反转录c DNA第一条链的合成
•     2.2.16 实时荧光定量PCR
•     2.2.17 线粒体复合物分析
•       2.2.17.1 线粒体复合物的提取
•       2.2.17.2 线粒体复合物丰度分析
•       2.2.17.3 线粒体复合物Ⅰ活性分析
•     2.2.18 Dek44 基因编辑载体的构建与农杆菌遗传转化
•       2.2.18.1 基因编辑载体的构建
•       2.2.18.2 表达载体质粒提取
•       2.2.18.3 EHA105 根癌农杆菌感受态的制备与遗传转化
•     2.2.19 农杆菌介导的玉米幼胚转化
• 3 结果与分析
•   3.1 dek44 突变体表型分析
•   3.2 dek44 突变体籽粒组织切片观察
•   3.3 目的基因的图位克隆
•     3.3.1 dek44 突变体的遗传鉴定
•     3.3.2 多态性SSR分子标记的筛选
•     3.3.3 目的基因的粗定位
•     3.3.4 目的基因的精细定位
•     3.3.5 目的基因的确认
•   3.4 Dek44 的进化树分析
•   3.5 Dek44 在玉米中呈组成型表达
•   3.6 dek44 突变体中线粒体功能发生异常
•     3.6.1 dek44 突变体中rps13和nad9 转录本的编辑效率显著下降
•     3.6.2 dek44 突变体中nad1和nad4 的内含子剪切受到严重影响
•     3.6.3 dek44 突变体中线粒体复合物Ⅰ的丰度和活性显著降低
•   3.7 dek44 突变体中替代呼吸途径中的Aoxs基因表达量升高
• 4 讨论
•   4.1 nad1和nad4 的内含子剪切对线粒体功能的正常发挥至关重要
•   4.2 rps13 转录本的编辑丧失可能对线粒体翻译体系产生负面影响
•   4.3 nad9 转录本的编辑效率下降可能对复合物Ⅰ活性有较大影响
•   4.4 Dek44 基因的深入验证
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 闫旭伟

导师: 赵翔宇,张宪省

关键词: 图位克隆,蛋白,编辑,内含子剪切,线粒体

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 山东农业大学

基金: 国家自然基金项目(9173530191535109),国家转基因专项(2016ZX08003-003),山东省泰山学者项目(ts201712024),山东省双一流建设(SYL2017YSTD03),作物生物学国家重点实验室导向课题(dxkt201707)

分类号: S513;Q943.2

总页数: 84

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