聚肌胞在JAK2及VEGF-A应答猪瘟病毒侵染中的调节作用研究

论文摘要

猪瘟是一种在猪身上引发的以高热及弥散性出血为特征的高度烈性传染病,临床病死率高,对养殖业危害很大。本论文通过生物信息学和分子生物学手段,在已获取的巨噬细胞应答猪瘟病毒（CSFV,Classical Swine Feve Virus）不同毒力株侵染的转录组学数据库中,分析获得差异性表达的信号通路相关基因。并建立猪瘟侵染巨噬细胞模型,检测分析JAK信号通路及血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A）等特定细胞因子的应答特征。同时开展聚肌胞抑制CSFV复制的验证性研究,并进一步讨论聚肌胞在JAK2及VEGF-A应答CSFV侵染中的调节作用。研究结果为深入理解CSFV感染机理及抗病毒治疗机制提供了基础数据。研究工作取得以下结果:（1）对CSFV石门株、C株感染巨噬细胞及对照组的高通量测序数据进行基于基因趋势表达分析的GO-TREE构建,发现CSFV石门株感染不仅可以影响细胞迁移、细胞生长、细胞增殖和细胞周期阻滞,还可以改变炎症反应、NF-κB调控、凋亡调控等特定细胞因子的活性。其中JAK-STAT通路在GO-TREE分析中被辨明是对CSFV石门株侵染应答的显著性通路。进一步建立CSFV石门株巨噬细胞侵染模型对JAKSTAT家族成员的侵染后应答开展分子生物学检测,定量PCR结果显示JAK2及STAT4在巨噬细胞中侵染CSFV石门株后转录出现显著性抑制。（2）差异基因表达分析结果同时表明VEGF-A在感染CSFV石门株的巨噬细胞中高表达。进一步开展分子生物学验证,实时荧光定量PCR（Quantitative Real Time PCR,qPCR）、Western blot以及激光共聚焦分析结果显示CSFV石门株侵染巨噬细胞后,VEGF-A的转录及蛋白表达水平出现了显著性上调。（3）对不同浓度聚肌胞及不同时间点处理CSFV石门株侵染的巨噬细胞开展定量PCR检测分析,结果显示聚肌胞对CSFV石门株在巨噬细胞中的复制具有显著性抑制作用,免疫荧光检测进一步支持了这一结论。GO-TREE分析提示JAK-STAT可能作为聚肌胞的抗病毒靶点,qPCR分析结果显示,聚肌胞可拮抗CSFV石门株在巨噬细胞中诱导的JAK2以及STAT4抑制,提示聚肌胞可能通过激活JAK-STAT通路来发挥抗病毒作用。同时研究结果显示,聚肌胞可抑制CSFV石门株诱导的巨噬细胞VEGF-A的上调表达,提示聚肌胞可能通过抑制病毒复制来缓解CSFV引发的炎性反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号对照表
• 缩略语对照表
• 第一章 绪论
•   1.1 抗病毒药物及CSFV的研究现状
•     1.1.1 抗病毒药物的研究进展
•     1.1.2 CSFV国内外研究进展
•   1.2 巨噬细胞在CSFV侵染中的应答
•   1.3 聚肌胞与病毒相关的研究现状
•   1.4 高通量测序技术在病毒与宿主细胞互作研究中的应用
• 第二章 CSFV石门株感染巨噬细胞后对JAK-STAT通路基因的影响
•   2.1 引言
•   2.2 实验
•     2.2.1 仪器与耗材
•     2.2.2 高通量测序分析设计
•     2.2.3 趋势分析
•     2.2.4 GO pathway分析和功能富集分析
•     2.2.5 GO-TREE分析
•     2.2.6 细胞培养及病毒感染
•     2.2.7 引物设计
•     2.2.8 巨噬细胞RNA的提取
•     2.2.9 cDNA的合成
•     2.2.10 差异基因表达检测的qPCR验证
•     2.2.11 免疫蛋白印迹实验
•     2.2.12 统计学分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 不同表达基因的趋势分析
•     2.3.2 GO Pathway分析
•     2.3.3 GO富集分析
•     2.3.4 差异表达基因的GO-TREE分析
•     2.3.5 CSFV石门株对巨噬细胞JAK1和JAK2转录水平的影响
•     2.3.6 CSFV石门株对巨噬细胞JAK1和JAK2蛋白表达的影响
•     2.3.7 CSFV石门株对STATs转录和蛋白水平的影响
•   小结
• 第三章 CSFV石门株感染致巨噬细胞VEGF-A上调表达
•   3.1 引言
•   3.2 实验
•     3.2.1 仪器与耗材
•     3.2.2 VEGF-A的基因表达差异分析
•     3.2.3 VEGF-A蛋白互作分析
•     3.2.4 VEGF-A的GO富集分析
•     3.2.5 VEGF-A的引物设计
•     3.2.6 细胞培养和病毒感染
•     3.2.7 巨噬细胞RNA的提取
•     3.2.8 cDNA的合成
•     3.2.9 qPCR检测VEGF-A mRNA的表达量变化
•     3.2.10 Western Blot检测VEGF-A蛋白表达量的变化
•     3.2.11 VEGF-A蛋白的激光共聚焦（Confocal）检测
•     3.2.12 统计学分析
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 生物信息学分析结果
•     3.3.2 PCR和 qPCR检测CSFV感染PAMs拷贝数的变化
•     3.3.3 qPCR验证PAMs感染CSFV石门株VEGF-A mRNA上调表达
•     3.3.4 Western blot和Confocal验证PAMs感染CSFV石门株后VEGF-A蛋白上调表达
•   小结
• 第四章 Poly（I:C）的抗病毒作用及其在JAK-2及VEGF-A应答CSFV侵染中的调节作用
•   4.1 引言
•   4.2 实验
•     4.2.1 仪器与耗材
•     4.2.2 细胞培养和病毒感染
•     4.2.3 巨噬细胞RNA的提取
•     4.2.4 RNA完整性验证
•     4.2.5 cDNA的合成
•     4.2.6 PCR检测Poly（I:C）对CSFV复制的抑制作用
•     4.2.7 qPCR验证Poly（I:C）对CSFV复制的抑制效果以及对信号通路的拮抗作用
•     4.2.8 免疫荧光验证Poly（I:C）对CSFV复制的抑制效果
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 RNA完整性检测及预实验PCR检测Poly（I:C）对CSFV复制的抑制作用
•     4.3.2 qPCR验证不同浓度Poly（I:C）对CSFV复制的抑制作用
•     4.3.3 qPCR验证不同时间梯度Poly（I:C）对CSFV复制的抑制作用
•     4.3.4 免疫荧光在蛋白水平验证Poly（I:C）对CSFV复制的抑制作用
•     4.3.5 Poly（I:C）和CSFV在JAK2-STAT4 通路上产生拮抗作用
•     4.3.6 Poly（I:C）通过抑制CSFV复制抑制VEGF-A的上调表达
•   小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 胡傲雪

导师: 张象涵,贾庆安

关键词: 聚肌胞,巨噬细胞,信号通路,血管内皮生长因子

来源: 西安电子科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西安电子科技大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27389/d.cnki.gxadu.2019.000627

总页数: 70

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