产乙醇酸的重组大肠杆菌转录组分析及代谢改造

论文摘要

乙醇酸（Glycolate,羟基乙酸,甘醇酸）是极具工业价值的双碳羟基羧酸,具有易降解易吸收等特性,应用于包装、纺织、医疗、化妆品等多个领域。本实验室在前期研究中构建的乙醇酸工程菌株Mgly545,在M9无机盐培养基中,以葡萄糖为碳源合成乙醇酸,最终乙醇酸产量达到16.66 g·L-1。但乙醇酸工程菌株发酵生产乙醇酸的过程中仍存在很多问题:M9培养基适合乙醇酸的生产,但不利于菌体生长,较低的菌体生物量使得乙醇酸生产效率低下,菌株存在菌体生长和乙醇酸产量之间的矛盾。针对以上问题,主要从以下三方面进行研究:（1）为实现工程菌株菌体生长和乙醇酸生产之间的平衡,提高乙醇酸积累效率,探究了不同氮源以及异柠檬酸脱氢酶ICDH敲除对菌体生长和乙醇酸合成的影响。有机氮源可改善Mgly545菌株生长,但会引起乙酸过量积累以及乙醇酸产量降低,不利于工业化生产。在Mgly545菌株基础上缺失ICDH的Mgly625菌株,以蛋白胨和酵母粉为有机氮源时,乙醇酸产量没有受到菌体生长的影响,合成效率为0.80 g·OD-1,是Mgly545在相同氮源中的2.6倍。（2）基于RNA-Seq技术,对Mgly545分别在无机氮源和有机氮源以及Mgly625在有机氮源中发酵的转录组进行比较。发现Mgly625中乙酰辅酶A合成酶acs的显著上调增强了菌株对乙酸的利用,减少了乙酸的积累;磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的显著上调增强了磷酸烯醇式丙酮酸PEP回补途径,使得碳源有效地合成乙醇酸。对这三种转录本胞内NADPH/NADP+进行测定并比较与NADPH合成代谢相关基因的转录水平,发现有机氮源可增强磷酸戊糖途径,为乙醇酸合成提供更多NADPH。ICDH敲除引起了68个基因表达的显著变化,基于此分析了Mgly625菌株中N调节、氨基酸代谢、氧化应激反应和铁转运等与细胞生长及乙醇酸合成的关系。发现添加谷氨酸和丝氨酸可提高Mgly625生物量和生产效率;过量表达精氨酸转运酶基因argT获得的菌株Mgly6252,细胞生长速度提高,生物量增加;培养基中Fe2+的补充可以加速细胞生长并补偿胞内缺乏的还原当量。最终Mgly6252菌株在5L发酵罐中乙醇酸产量达到22.43 g·L-1。（3）为了高通量筛选高产乙醇酸的突变菌株,本研究构建了可实时监测乙醇酸积累水平的生物传感器。在大肠杆菌中,转录调节蛋白GlcC受乙醇酸诱导,从而激活glcD基因的转录。利用PglcD启动子调控绿色荧光蛋白基因（sfGFP）表达,从而构建乙醇酸传感器,将荧光信号与胞内乙醇酸浓度偶联。同时构建了高拷贝传感器质粒pGBS-H和低拷贝传感器质粒pGBS-L。经乙醇酸体外诱导比较,低拷贝传感器对不同浓度乙醇酸的响应较好,检测范围为0-50 mM。在实时检测乙醇酸产量过程中,荧光强度与乙醇酸产量具有较好的线性关系（R2=0.9086）。通过优化PglcD与基因sfGFP之间的RBS,进一步提高了传感器的响应值和检测限。研究还表明全局调控子（ArcA）在微好氧条件下会抑制传感器中荧光蛋白的表达。利用定向进化策略改造了异柠檬酸裂解酶（AceA）,强化了乙醇酸合成。基于乙醇酸生物传感器所建立的定向进化策略极大地简化了筛选流程,为乙醇酸工业微生物快速改造提供了方法借鉴。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 乙醇酸性质及应用
•   1.2 全生物合成法生产乙醇酸研究现状及问题
•     1.2.1 微生物发酵法生产乙醇酸的现状
•     1.2.2 大肠杆菌生产乙醇酸面临的挑战
•   1.3 转录组学研究进展
•     1.3.1 转录组定义及研究内容
•     1.3.2 转录组测序技术的分类及优缺点
•     1.3.3 转录组学的应用
•   1.4 生物传感器研究进展
•     1.4.1 生物传感器定义及分类
•     1.4.2 基因编码的生物传感器的应用
•     1.4.3 乙醇酸生物传感器
•   1.5 本课题的立题意义与研究内容
•     1.5.1 立题意义
•     1.5.2 主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 主要试剂及药品
•     2.1.2 工具酶
•     2.1.3 主要实验仪器
•     2.1.4 质粒与菌株
•     2.1.5 培养基
•   2.2 方法
•     2.2.1 基因PCR扩增体系
•     2.2.2 Gibson组装反应液的配制
•     2.2.3 大肠杆菌感受态的制备
•     2.2.4 大肠杆菌基因敲除
•     2.2.5 质粒构建
•     2.2.6 菌株培养方法
•     2.2.7 发酵液的测定
•     2.2.8 转录组测序及数据分析
•     2.2.9 NADPH及 NADP+的测定
•     2.2.10 不同浓度乙醇酸诱导传感器
•     2.2.11 传感器对乙醇酸产量的实时检测
•     2.2.12 RBS优化
•     2.2.13 易错PCR突变异柠檬酸裂解酶ace A基因
•     2.2.14 AceA突变菌株高通量筛选
•     2.2.15 异柠檬酸脱氢酶酶活测定
• 第三章 结果与分析
•   3.1 异柠檬酸脱氢酶ICDH的敲除及发酵培养基的选择
•     3.1.1 异柠檬酸脱氢酶ICDH的敲除
•     3.1.2 Mgly625 菌株发酵培养基的选择
•     3.1.3 Mgly545与Mgly625 分批发酵过程对比
•   3.2 转录组测序结果分析
•     3.2.1 转录组测序数据整体分析
•     3.2.2 乙醇酸合成途径基因转录水平比较
•     3.2.3 胞内辅因子NADPH/NADP+的测定及分析
•     3.2.4 显著变化基因的分析
•     3.2.5 Mgly6252 菌株上罐发酵接种量优化
•   3.3 乙醇酸传感器的构建及初步探究
•     3.3.1 乙醇酸对高低拷贝传感器的体外诱导
•     3.3.2 传感器实时检测乙醇酸产量
•     3.3.3 RBS优化传感器检测限
•     3.3.4 微氧条件下乙醇酸传感器应答及Arc A对传感器抑制作用
•     3.3.5 乙醇酸传感器在高通量筛选中的应用
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 A：补充材料
• 附录 B：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱康佳

导师: 邓禹

关键词: 乙醇酸,大肠杆菌,敲除,生物传感器

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ921

总页数: 55

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