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CRISPR cas9基因编辑方法系统性研究小鼠生物钟基因对温度补偿和细胞周期的调控

2020-12-08阅读(702)

CRISPR cas9基因编辑方法系统性研究小鼠生物钟基因对温度补偿和细胞周期的调控

论文摘要

小鼠生物钟受到昼夜节律基因的调控,昼夜节律基因能够产生自我维持、自主振荡的以～24小时为周期的生物节律。昼夜节律中存在的一个主要的调节通路是核心生物钟组分BMAL1/CLOCK形成异二聚体,结合在转录抑制因子PER和CRY基因启动子的E-box区,激活per和cry的转录,当细胞质中PER和CRY达到一定浓度后,PER和CRY形成异二聚体入核使BMAL1/CLOCK从E-box上脱离,抑制其对自身的激活作用。除此之外,在小鼠细胞中,还有很多基因参与到生物钟的调控,如转录因子基因:mciart,mdbp.mnfil3,mdec1,mdec2,mnpas2;核受体家族基因:mrora,mrorb,mrorc和mnr1d1,mnr1d2,能够与mbmal 的RORE结合位点结合后分别作为正向和负向调控因子调节mbmal1的转录;介导PER和CRY蛋白泛素化降解的E3连接酶基因:mbeta-trcp和mfbxl21,mfbxl3;介导PER和CRY磷酸化的磷酸激酶家族基因:mcsnk1d,mcsnkle,以及目前在细胞水平昼夜节律相关研究不深入的mtimeless和mmyc。本论文的研究目的是利用基因编辑方法系统的研究这25个基因对昼夜节律周期长度,温度补偿和细胞周期的调控。以这25个基因为研究对象,通过CRISPR cas9基因编辑系统成功获得了22个单个基因在小鼠成纤维细胞中被编辑的细胞株,并且通过脱靶分析后未发现基因编辑过程中存在脱靶现象。通过Lumicycle Reporter实验,将获得的基因编辑细胞株的节律周期变化情况与文献报道的小鼠实验相关节律基因敲除后的节律周期变化结果相对比,相对于野生型而言大部分基因改变后节律周期的变化趋势基本一致;通过32.5℃和37℃下对昼夜节律周期长度的统计及温度补偿系数Q10的计算,发现大部分基因的编辑并不会对生物钟的温度补偿这一生物钟特性产生较大的影响,但mcsnk1e和mbeta-trcp的Q10小于0.8,这两个基因可能与温度补偿的维持相关;mbmal1,mcry1 mper1,mper3,mfbxl3基因发生编辑后节律周期随温度增加而降低,其他则相反,说明温度补偿可以通过周期增加和周期减少过程平衡来实现的,温度补偿是一个复杂的基因调控系统。在研究生物节律相关基因对细胞周期调控的过程中,首先通过MTT 比色法绘制细胞生长曲线,通过二分裂生长曲线函数拟合生长曲线并计算所得的细胞倍增时间发现,mclock-F12,mcry1-D4,mper1-B7,mper2-A3,mper3-D4,mnr1d2-F4,mcsnk1e-B5,基因编辑细胞株细胞增殖周期明显变长,其他节律基因的编辑对细胞倍增时间长度的影响不大;我们通过细胞流式分析实验进一步对节律周期表型变化较明显的细胞株进行了细胞周期时相分布的研究,发现mcry1-D4,mper1-B7,mper1-C1,mfbxl3-A9,mfbx121-C11,mrora-D2,mdec2-E8,mnfil3-B12细胞株细胞周期阻滞在G1期;mbmal-D8,mcry2-H3基因编辑细胞株细胞周期阻滞在G2/M期;mcsnk1d-D2细胞株细胞周期阻滞在S期。除此之外还有细胞株mcsnkle-B5,S期细胞相对于野生型来讲明显降低,mclock-F12,mcry 1-C9,mbeta-btrcC9,mnpas 2-B8,mdbp-F4,mnr1d2-F4细胞株G2/M期变化明显并且mnpas2-B8出现了染色体加倍的可能性。这也说明了节律基因对细胞周期调控的一个主要方面是对细胞周期检验点的调控等方面的研究。我们的研究通过CRISPR cas9基因编辑方法对25个节律相关基因进行编辑,一方面能够系统的研究节律基因编辑后对生物节律的影响,验证并且补充节律基因对生物钟调控的研究,并且研究了节律基因对温度补偿的调控;另一方面通过节律基因编辑后对细胞周期的长度及时相分布的研究,系统的研究了节律基因在细胞周期调控所起的作用。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 背景介绍
  •   1.1 生物钟背景
  •     1.1.1 生物钟及其意义
  •     1.1.2 生物钟的分子机制
  •     1.1.3 生物钟的温度补偿
  •   1.2 生物钟对细胞周期的调控
  •   1.3 CRISPR cas9基因编辑系统
  • 第二章 实验材料与方法
  •   2.1 实验试剂及材料
  •     2.1.1 实验所需细胞,菌种和质粒
  •     2.1.2 试剂及来源
  •   2.2 试剂和溶液的配制
  •   2.3 实验仪器及型号
  •   2.4 实验方法
  •     2.4.1 细胞培养
  •     2.4.2 细胞冻存
  •     2.4.3 细胞复苏
  •     2.4.4 DH5 α大肠杆菌感受态细胞的制备
  •     2.4.5 菌落筛选
  •     2.4.6 PCR产物的回收
  •     2.4.7 普通质粒提取步骤
  •     2.4.8 胶回收实验方法
  •     2.4.9 去内毒素质粒提取实验
  •     2.4.10 基因组的提取
  • 第三章 节律基因系统性编辑
  •   3.1 实验方法及步骤
  •     3.1.1 px459-sgRNA载体的构建
  •     3.1.2 细胞转染及基因编辑单细胞株筛选
  •   3.2 基因编辑序列分析
  •     3.2.1 基因编辑单胞鉴定
  •     3.2.2 T7E1核酸内切酶酶切
  •     3.2.3 pLB零背景克隆
  •   3.3 实验结果及分析
  •   3.4 CRISPR cas9基因编辑系统的脱靶分析
  •     3.4.1 节律基因编辑脱靶位点的统计效应分析的引物设计
  •     3.4.2 节律基因编辑脱靶位点引物的设计
  •     3.4.3 PCR扩增潜在脱靶目的序列
  •     3.4.4 PCR产物的回收
  •     3.4.5 序列比对
  • 第四章 节律基因对生物钟节律周期长度及温度补偿的影响
  •   4.1 细胞株Lmicycle Reporter实验
  •   4.2 实验方法和步骤
  •   4.3 节律周期长度实验结果及分析
  •   4.4 节律基因在温度补偿中的作用
  •     4.4.1 温度补偿分析的实验方法
  •     4.4.2 温度补偿实验结果及分析
  • 第五章 节律基因对细胞周期的调控
  •   5.1 节律基因对细胞倍增时间的调控
  •     5.1.1 实验步骤和方法
  •     5.1.2 实验结果与分析
  •   5.2 节律基因对细胞周期时相分布的调控
  •     5.2.1 细胞流式分析
  •     5.2.2 实验步骤及方法
  •     5.2.3 实验结果及分析
  • 第六章 总结与讨论
  •   6.1 结论
  •   6.2 展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 田田

    导师: 秦曦明

    关键词: 昼夜节律,节律基因,温度补偿,细胞周期,基因编辑

    来源: 安徽大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 安徽大学

    分类号: Q78

    总页数: 107

    文件大小: 7912K

    下载量: 105

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