一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养液和培养方法论文和设计-张涌

全文摘要

本发明公开了一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养液，培养液中包括以下添加剂：胰岛素‑转铁蛋白‑硒添加剂、β‑巯基乙醇、亚牛磺酸、1‑油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸钠盐和红景天苷。并且公开了使用该培养液提高牛体外受精胚的发育质量的培养方法。应用本发明培养液及培养方法有效提高牛体外受精胚胎的发育率和发育质量。

主设计要求

1.一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养液，其特征在于，所述培养液包括SOF基础培养基、必需氨基酸、非必需氨基酸和无脂肪酸牛血清白蛋白；所述培养液中还包括以下添加剂：胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、β-巯基乙醇、亚牛磺酸、1-油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐和红景天苷；胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂体积分数为0.1-2%，β-巯基乙醇浓度为10-100μM，亚牛磺酸浓度为1-10mM，1-油酰基-SN-甘油-3-磷酸钠盐浓度为0.1-1µg\/mL，红景天苷浓度为0.01-0.2mM。

设计方案

2.根据权利要求1所述的一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养液，其特征在于，必需氨基酸体积分数为0.1-2%，非必需氨基酸体积分数为0.1-2%，无脂肪酸牛血清白蛋白浓度为1-10mg\/mL。

3.根据权利要求2所述的一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养液，其特征在于，每100mL SOF基础培养基包括26.168mg CaCl _{2<\/sub>•2H_{2<\/sub>O、9.999mg C _{6<\/sub>H_{5<\/sub>Na_{3<\/sub>O_{7<\/sub>•2H_{2<\/sub>O、2.923mg 谷氨酰胺、37.218mg MgSO _{4<\/sub>•7H_{2<\/sub>O、49.904mg 肌醇、1.000mg 酚红、53.378mg KCl、16.195mgKH _{2<\/sub>PO_{4<\/sub>、4.402mg丙酮酸钠、210.025mg NaHCO _{3<\/sub>、629.399mg NaCl和0.0757mg 乳酸钠。}}}}}}}}}}}}

4.根据权利要求3所述的一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养液，其特征在于，所述培养液中还包括庆大霉素12µg\/mL和头孢霉素12µg\/mL。

5.一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养方法，其特征在于，将牛体外受精胚置于权利要求1-4中任一项所述的培养液中进行培养。

6.根据权利要求5所述的一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养方法，其特征在于，对培养液预热至少2小时，然后将牛精卵结合16-22h的体外受精胚加入培养液中，CO_{2<\/sub>培养箱中培养7-8天。}

7.根据权利要求6所述的一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养方法，其特征在于，胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、β-巯基乙醇、亚牛磺酸、1-油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐和红景天苷在预热时添加于培养液中。

8.根据权利要求7所述的一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养方法，其特征在于，牛体外受精胚在38.5℃、5%CO_{2<\/sub>、饱和湿度下培养。}

设计说明书

技术领域

本发明涉及家畜胚胎工程领域，更具体的说是涉及一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养液和培养方法。

背景技术

家畜胚胎体外培养是一项具有潜在的研究价值和商用价值的技术，可广泛应用于胚胎体外移植、动物基因编辑育种及优良家畜品种扩增等方面。但至今体外培养获得的胚胎在质量及数量上往往不及在体内正常发育的胚胎，体外受精胚胎在胚胎致密化阶段发育迟缓，导致胚胎卵裂率逐渐下降，形成囊胚的细胞数目少，进而损害胚胎质量，影响早期胚胎体外发育，显著制约着此技术的广泛应用。

因此，如何提高牛体外受精胚发育率和发育质量是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种培养液和培养方法，可有效提高牛体外受精胚发育率和发育质量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养液，培养液中包括以下添加剂：胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、β-巯基乙醇、亚牛磺酸、1-油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐和红景天苷。

胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂ITS-G能够较好的维持细胞的体外存活和增殖；β-巯基乙醇可促进细胞增殖，减缓细胞衰老速率，利于细胞的生长；亚牛磺酸能中和细胞毒素乙醛-过氧化级联反应的最终物质,从而限制ROS的有害作用；1-油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠能够促进细胞增殖；红景天苷具有提高细胞活力，改善细胞形态，减少胞核凝集，抗细胞氧化应激的保护作用。

五种添加剂添加到培养液中，可有效降低牛体外受精胚的氧化损伤，提高牛体外受精胚发育率和发育质量。

优选地，胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂体积分数为0.1-2％，β-巯基乙醇浓度为10-100μM，亚牛磺酸浓度为1-10mM，1-油酰基-SN-甘油-3-磷酸钠盐浓度为0.1-1μg\/mL，红景天苷浓度为0.01-0.2mM。

优选地，培养液还包括SOF基础培养基、必需氨基酸、非必需氨基酸和无脂肪酸牛血清白蛋白EFAF-BSA。

优选地，必需氨基酸体积分数为0.1-2％，非必需氨基酸体积分数为0.1-2％，无脂肪酸牛血清白蛋白浓度为1-10mg\/mL。

通过控制必需氨基酸、非必需氨基酸及无脂肪酸牛血清白蛋白可进一步提高牛胚胎体外发育质量。

优选地，每100mL SOF基础培养基包括26.168mg CaCl _{2<\/sub>·2H_{2<\/sub>O、9.999mgC_{6<\/sub>H_{5<\/sub>Na_{3<\/sub>O_{7<\/sub>·2H_{2<\/sub>O、2.923mg谷氨酰胺、37.218mg MgSO _{4<\/sub>·7H_{2<\/sub>O、49.904mg肌醇、1.000mg酚红、53.378mg KCl、16.195mg KH _{2<\/sub>PO_{4<\/sub>、4.402mg丙酮酸钠、210.025mg NaHCO _{3<\/sub>、629.399mg NaCl和0.0757mg乳酸钠。}}}}}}}}}}}}

优选地，培养液中还包括庆大霉素12μg\/mL和头孢霉素12μg\/mL。

一种提高牛体外受精胚的发育质量的培养方法，将牛体外受精胚置于上述培养液中进行培养。

优选地，对培养液预热至少2小时，然后将牛精卵结合16-22h的体外受精胚加入培养液中，CO_{2<\/sub>培养箱中培养7-8天。}

胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、β-巯基乙醇、亚牛磺酸、1-油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐和红景天苷于胚胎发育之前(牛精卵结合16-22h)添加到培养体系中，能够充分发挥其作为胚胎培养环境作用因子的积极作用，高效率地获得牛体外受精胚胎，显著提高牛体外受精胚胎发育率、囊胚数及囊胚细胞数，大幅降低制备胚胎的生产成本。

优选地，胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、β-巯基乙醇、亚牛磺酸、1-油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐和红景天苷在预热时添加于培养液中。

优选地，牛体外受精胚在38.5℃、5％CO_{2<\/sub>、饱和湿度下培养。}

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明培养液中添加有胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、β-巯基乙醇、亚牛磺酸、1-油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐和红景天苷，可有效提高牛体外受精胚胎的发育率和发育质量。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(一)试剂的来源及制备

胰蛋白酶、EDTA、庆大霉素、头孢霉素、无机盐、石蜡油(M8410)为sigma公司产品；

无Hepes的M199基础培养液为Thermo公司产品；

特级胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品；

必需氨基酸为Thermo Fisher公司产品(货号1831512)；

非必需氨基酸为Thermo Fisher公司产品(货号1958909)；

无脂肪酸牛血清白蛋白EFAF-BSA为sigma公司产品(货号A6003-5G)；

胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂ITS-G为Thermo Fisher公司产品(货号1865342，胰岛素1g\/L，转铁蛋白0.55g\/L，硒0.00067g\/L)；

β-巯基乙醇为Thermo Fisher公司产品(货号1922445)；

亚牛磺酸为sigma公司产品(货号H1384)；

1-油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠为Enzo Life Science公司产品(货号LP100-0025)；

红景天苷为sigma公司产品(货号SMB00072-1MG)；

SOF基础培养基为自行配置；

其他未标明的均为sigma公司产品。

a.卵母细胞体外成熟培养液

无Hepes的M199基础培养液中添加10％(v\/v)胎牛血清、1％(v\/v)ITS-G、0.075IU\/mL HMG、1μg\/mL 17β-雌二醇、10ng\/mL EGF、12ng\/mLbFGF和50ng\/mL CXCL12。

b.SOF溶液、SOFaa溶液、mSOFaa溶液

SOF溶液：26.168mg CaCl _{2<\/sub>·2H_{2<\/sub>O、9.999mg C _{6<\/sub>H_{5<\/sub>Na_{3<\/sub>O_{7<\/sub>·2H_{2<\/sub>O、2.923mg谷氨酰胺、37.218mg MgSO _{4<\/sub>·7H_{2<\/sub>O、49.904mg肌醇、1.000mg酚红、53.378mg KCl、16.195mg KH _{2<\/sub>PO_{4<\/sub>、4.402mg丙酮酸钠、210.025mg NaHCO _{3<\/sub>、629.399mg NaCl、0.0757mg乳酸钠，去离子水定容到100mL，1mM NaOH调pH到7.2-7.4。}}}}}}}}}}}}

SOFaa溶液：以SOF溶液作为基础培养液，添加体积分数1％的必需氨基酸、体积分数1％的非必需氨基酸、6mg\/mL无脂肪酸牛血清白蛋白、12g\/mL庆大霉素和12μg\/mL头孢霉素。

mSOFaa溶液：以SOFaa溶液作为基础培养液，预热时添加体积分数为1％的ITS-G、55μMβ-巯基乙醇、2.5mM亚牛磺酸、0.4μg\/mL 1-油酰基-SN-甘油-3-磷酸钠盐和0.1mM红景天苷。

c.BO液

BO液是以不含肌醇的SOF溶液作为基础培养液，还包含有48mg\/mL无脂肪酸牛血清白蛋白，12μg\/mL庆大霉素、12μg\/mL头孢霉素、0.1942mg\/mL咖啡因及0.05mg\/mL肝素钠。

(二)牛体外受精胚胎的制备方法

a.卵母细胞的成熟培养

牛卵巢采自陕西省西安市三桥定点屠宰场(采集时间2017年1月至2017年12月)，将卵巢置于保温瓶内含200U\/ml青霉素、0.2mg\/ml链霉素的20-25℃的生理盐水中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2-8mm卵泡中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中，在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocytecomplexes,COCs)。收集后在含10％胎牛血清的PBS中清洗三遍。选择卵母细胞形态正常的COCs用于体外成熟培养(记为总卵母细胞数)。

将选择的COCs在卵母细胞体外成熟培养液中洗两遍，然后移入装有3mL卵母细胞体外成熟培养液(提前在38.5℃培养箱平衡一小时)的3cm平皿中，在38.5℃、5％CO_{2<\/sub>、饱和湿度条件下培养20-22h。将培养成熟的COCs用1000mL移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打至COCs周围只剩下紧密包裹的四到五层卵丘细胞时，在受精液(BO液)中洗2次，洗干净吹下的游离卵丘细胞，然后将紧密包裹四到五层卵丘细胞的卵母细胞移至受精液滴(提前放置到38.5℃培养箱中平衡2h以上)中。}

b.精子的解冻、纯化、受精

将冻精(西安市奶牛中心，2013年10月采集)从液氮罐取出后，放置于37℃水浴解冻，离心管中做Percoll分层液。将2mL 90％Percoll液置于离心管底部，把2mL45％Percoll液小心加到90％Percoll液面上，再将解冻后的精子置于45％Percoll液面上，1500rpm离心20min，小心吸取底部约200μL精液加入至含有卵母细胞的受精液(BO液)中，放回培养箱内使精卵进行结合20h。

c.受精胚胎的培养

处理组：于四孔板中添加mSOFaa溶液，每孔500μL，液面上覆盖500μL石蜡油，预先在38.5℃、5％CO_{2<\/sub>、饱和湿度培养箱中平衡至少2h。}

受精完毕后用口吸管或者枪头吹去卵子周围的残存卵丘细胞和精子，获得假定受精的牛体外受精胚，置于四孔板的mSOFaa溶液中，每孔40枚左右，38.5℃、5％CO_{2<\/sub>、饱和湿度培养箱中培养72h，挑出未卵裂的受精胚，放回培养箱继续培养至第八天(192h)。}

对照组1用SOFaa溶液培养。

对照组2所使用的培养液在SOFaa溶液基础上添加3mM谷胱甘肽。

对照组3所使用的培养液在SOFaa溶液基础上仅添加55μMβ-巯基乙醇。

观察并记录各组发育情况，试验结果如表1所示。

表1

a、b上标不同表示显著，显著性使用卡方检验来检测；AB级囊胚为可移植囊胚，C级为不推荐移植囊胚，囊胚ABC分级是根据国际胚胎移植协会的囊胚质量评分标准来评定。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

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