导读:本文包含了葡激酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:激酶,突变,蛋白质,水蛭,活性,结构,聚乙烯。
葡激酶论文文献综述
祁芳冰[1]（2019）在《基于八臂PEG聚集和阿拉伯半乳聚糖-PEG修饰的长效葡激酶及其药学性质研究》一文中研究指出葡激酶(SAK)由于具有良好的溶解纤维蛋白的活性,可用于冠状动脉血栓和急性心肌梗塞的治疗。然而,SAK在体内的循环半衰期很短,需要重复给药才能维持其生理作用,这将给患者带来极大的痛苦;此外,SAK具有较强的免疫原性、稳定性较差,这些都限制了SAK的临床应用。聚乙二醇(PEG)修饰和多糖(PS)修饰可以延长SAK的循环半衰期,并降低其免疫原性,但同时会降低SAK的生物活性。为了解决以上问题,本论文选择去掉N-末端前10位氨基酸残基,且C-末端引入Gly-Gly-Cys的重组SAK作为研究对象,以降低野生型SAK的免疫原性,且能实现远离SAK活性区域的定点修饰。本论文设计采用8-arm PEG定点修饰SAK,探索使SAK多聚化的修饰方法对SAK药代动力学和生物活性等性质的影响。另外,采用低分子量的PEG为连接桥,介导阿拉伯半乳聚糖(AG)修饰SAK,探索该修饰方法对SAK免疫原性、药代动力学和生物活性等性质的影响。采用8-arm PEG-MAL 10 kDa定点修饰SAK的C-末端巯基,并用两种不同的线性PEG修饰剂mPEG-MAL 10 kDa和MAL-PEG-MAL 10 kDa定点修饰SAK作对照,制备并纯化了3种SAK的PEG修饰产物。结果表明,3种PEG修饰方法均不会改变SAK的二级结构,但是会对SAK的叁级结构造成轻微的影响。SAK经PEG修饰后,其水化动力学体积均明显增大,热稳定性显着提高,体内循环半衰期得以延长,其他药代动力学参数也有显着的改善。其中,SAKp-PEG具有最大的水化动力学体积,表现出了最佳的药代动力学性质。PEG修饰会屏蔽SAK的活性区域,导致3种PEG修饰产物的体外生物活性有所降低。其中,SAKp-PEG能保持高达90%以上的生物活性。PEG修饰也会对SAK的抗原表位产生屏蔽作用,导致SAK免疫原性降低,但其降低的程度会随着SAK的二聚化或多聚化导致的分子量增大而被抵消。与SAK相比,SAKp-PEG的免疫原性仅稍微增强。此外,SAKp-PEG对小鼠的心、肝、肾均无明显的毒性。因此,通过采用8-arm PEG使蛋白质药物多聚化,能大幅延长蛋白质药物的半衰期,并保留了较高的生物活性。采用两种不同分子量的异型双功能低分子量PEG分别连接AG和SAK,得到SAK-P2K-AG年和SAK-P5K-AG,设计SAK-AG、SAK-P2K和SAK-P5K叁个对照组,制备并纯化了的5种SAK的修饰产物。研究结果表明,AG和PEG修饰均不会改变SAK的二级结构。与PEG相比,AG会对SAK产生更强的屏蔽作用,导致SAK-AG在5种修饰产物中荧光强度最弱、生物活性最低、免疫原性显着降低。而在SAK和AG之间引入PEG连接桥,能够降低AG对SAK的空间屏蔽作用,导致SAK-P2K-AG和SAK-P5K-AG比SAK-AG的荧光强度有显着增强、生物活性大幅提高、免疫原性降低。AG和PEG修饰能协同降低SAK的免疫原性,且不会引发抗AG和抗PEG的抗体产生。SAK经AG和PEG修饰后,其水化动力学体积均明显增大,导致体内循环半衰期延长,其他药代动力学参数也有显着的改善。其中,SAK-P5K-AG的水化动力学体积最大,药代动力学性质改善最为显着。这表明AG和更高分子量的PEG修饰可以协同增大SAK的水化动力学体积,并改善药代动力学性质。此外,AG和PEG修饰均不会对小鼠的心、肝、肾产生明显的毒性。该研究的修饰策略为研制新型长效蛋白质药物提供了一种有效的方法。(本文来源于《中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)》期刊2019-06-01）
徐彦颖[2]（2017）在《新型聚乙二醇化葡激酶的制备及功能鉴定研究》一文中研究指出目的通过对葡激酶(SAK)基因序列进行定点突变、表达、纯化与进行聚乙二醇修饰以获得较高纯度的聚乙二醇化葡激酶(peg-SAK-cys),并对其溶栓活性与免疫原性初步进行验证。方法设计引物将根据SAK晶体结构与预测抗原位点所挑选的82号氨基酸突变为半胱氨酸并将突变质粒通过化学转化进入BL21(DE3)感受态。利用经典原核表达技术表达突变葡激酶蛋白(SAK-cys)。利用镍离子交换柱、分子筛等方法分离纯化SAK-cys蛋白并对其进行聚乙二醇修饰。用纤维蛋白平板溶圈法和血栓弹力图初步对本次实验制备的peg-SAK-cys与课题组以相同方法制备的另外4种peg-SAK-cys的生物活性进行验证。以酶联免疫吸附(ELISA)法评价这些peg-SAK-cys的免疫原性。分析体外实验数据,并对功能评价较高的peg-SAK-cys通过动物栓塞实验模型进一步功能验证。结果成功获得了82号氨基酸突变的葡激酶质粒,表达、纯化了突变蛋白,并进行聚乙二醇修饰获得了第82号葡激酶突变的葡激酶蛋白(peg-SAK-C82A),分离纯化后纯度在总蛋白质量的90%以上。统计分析与计算溶圈实验结果,第97号与104号氨基酸突变的聚乙二醇化葡激酶(peg-SAK-C97A、peg-SAK-C104G)保留了较高的活性;血栓弹力图实验数据也支持了这一结果;免疫原性测定结果提示peg-SAK-C104G的免疫原性显着低于野生型SAK(P=0.0002);评价peg-SAK-C104G对SD大鼠颈动脉栓塞模型的溶栓效果,显示蛋白于体内实验也保留了相当的溶栓能力。结论通过位点特异性特变与聚乙二醇修饰技术的联合运用可以成功改造出有较低免疫原性的活性葡激酶。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2017-05-01）
徐彦颖,白垒,汪德强,周建中[3]（2017）在《新型聚乙二醇化葡激酶的表达、纯化及功能鉴定研究》一文中研究指出目的通过对葡激酶(SAK)基因序列进行定点突变、表达、纯化与进行聚乙二醇修饰以获得较高纯度的聚乙二醇化葡激酶(peg-SAK-cys),并对其溶栓活性与免疫原性初步进行验证。方法根据SAK蛋白晶体结构及抗原位点选择突变位点,设计引物将所选的氨基酸突变为半胱氨酸。将突变质粒通过化学转化进入BL21(DE3)感受态,并利用经典原核表达技术,在大肠杆菌中表达突变葡激酶(SAK-cys)。利用镍离子交换柱、分子筛等方法分离纯化目的蛋白。用纤维蛋白平板溶圈法和血栓弹力图初步对其生物活性进行验证。以酶联免疫吸附(ELISA)法评价peg-SAK-cys的免疫原性。结果成功获得了SAK-cys质粒,表达、纯化了突变蛋白,并进行聚乙二醇修饰获得了peg-SAK-cys,分离纯化后纯度在总蛋白质量的90%以上。计算其溶圈实验结果,活性为8.2×10~4IU·mg~(-1);血栓弹力图实验结果提示其具有较高的溶栓活性;免疫原性测定结果提示peg-SAK-cys免疫原性低于野生型SAK(P=0.000 2)。结论通过位点特异性特变与聚乙二醇修饰技术的联合运用可以成功改造出有较低免疫原性的活性SAK。(本文来源于《中国新药与临床杂志》期刊2017年04期）
白垒,徐彦颖,汪德强,周建中[4]（2017）在《葡激酶聚乙二醇修饰及活性鉴定研究》一文中研究指出目的:通过对葡激酶(staphylokinase,SAK)基因序列进行定点突变,表达突变蛋白,并对其进行聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰。通过分子筛分离得到较高纯度修饰蛋白,在体内外鉴定其溶栓活性。方法:根据SAK晶体结构及抗原位点选择突变位点,构建突变质粒,并在大肠杆菌中表达半胱氨酸(cysteine,Cys)突变蛋白S-cys;分离纯化目的蛋白;对目的蛋白在不同条件下进行聚乙二醇修饰,筛选最优修饰条件;分离修饰蛋白与未修饰蛋白,得到较高纯度的修饰蛋白peg-S-cys,通过纤维蛋白平板溶圈实验和动物栓塞模型的构建初步对其生物活性进行验证。结果:原核表达、纯化后得到纯度较高的S-cys突变体蛋白;优化筛选S-cys蛋白的PEG修饰实验参数,得到最佳修饰条件;应用分子筛分离纯化,成功获得纯度较高的peg-S-cys蛋白(纯度大于90%);初步验证peg-S-cys具有溶栓活性。结论:通过对蛋白质基因序列的定点突变,成功实现了蛋白质的聚乙二醇定点修饰,在体外和体内初步验证其活性,为蛋白质改造提供了一种新的方法与思路。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2017年07期）
白垒[5]（2016）在《葡激酶改造：定点突变与聚乙二醇修饰联合应用及初步功能验证》一文中研究指出目的:通过对葡激酶蛋白(SAK,S)基因序列进行定点突变,然后在多种条件下对突变蛋白进行聚乙二醇修饰,筛选出最优修饰条件。并通过分子筛分离得到较高纯度修饰蛋白,并对其生物活性进行初步验证。方法:根据S蛋白晶体结构及抗原位点选择突变位点,设计突变引物,将S蛋白上选定的氨基酸突变为半胱氨酸;将突变质粒通过化学转化进BL21(DE3)感受态,并利用经典原核表达技术,在大肠杆菌中表达突变蛋白S-cys;利用离子亲和层析、离子交换层析、分子筛等方法分离纯化目的蛋白;对目的蛋白在不同条件下进行聚乙二醇修饰,观察并评价修饰温度、修饰时间、蛋白质:修饰剂摩尔比等因素对修饰率的影响;二次分离,将修饰蛋白与未成功修饰蛋白分离开来,得到较高纯度的修饰蛋白peg-S-cys,并通过纤维蛋白平板溶圈实验和动物栓塞模型的构建初步对其生物活性进行验证。结果:(1)成功将选定氨基酸突变为半胱氨酸。(2)原核表达、纯化后得到了纯度较高的S-cys蛋白。(3)在多种条件下对S-cys蛋白进行修饰,根据修饰后SDS-PAGE结果得到最佳修饰条件。(4)应用分子筛分离纯化,成功获得纯度较高的peg-S-cys蛋白。(5)初步验证peg-S-cys具有溶栓活性。结论:通过对蛋白质基因序列的定点突变,成功实现了蛋白质的聚乙二醇定点修饰,在体外和体内初步验证其活性,为蛋白质改造提供了一种新的方法与思路。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2016-05-01）
董耘,徐昕,李斌,柯丽娜,陈武[6]（2015）在《重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外的抗凝溶栓作用分析》一文中研究指出目的通过构建STH融合蛋白发酵及分离纯化工艺,用以获取蛋白,并探讨其在体外的抗凝溶栓作用。方法采用琼脂糖-纤维蛋白溶圈法对样品STH的溶栓活性进行测定;SDS-PAGE、Western Blot、发色底物法以及纤维蛋白凝块溶解法分别分析STH和裂解产物的抗凝活性,并根据血栓弹力图来分析STH在体外所具有的溶栓、抗凝作用。结果在STH中,HV2的C-末端对凝血酶仍具有显着的亲和力,使STH对血栓具有较高的靶向性;STH在凝血酶裂解的情况下能将抗凝活性释放开来,是指具有溶栓、抗凝双重作用。结论 STH生产工艺操作起来简便,便于大规模生产;通过分析STH在体外所具有的功能,结果表明:STH在具有溶栓、抗凝作用的基础上,其对血栓也有显着的靶向性,但其出血副作用不大。(本文来源于《血栓与止血学》期刊2015年06期）
徐华,董耘,杨进,刘少帮,刘少华[7]（2015）在《重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建表达》一文中研究指出背景:重组融合蛋白是根据凝血酶识别顺序将葡激酶与水蛭素串联而成的蛋白,具有双重功能,分子质量为23 ku,可在工程菌高密度发酵状态下获得高效表达。目的:通过对工程菌进行高密度发酵,构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并探讨其构建可行性及表达价值。方法:对工程菌进行高密度培养,并诱导表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白,对菌体进行离心收取,多次冻融后通过超滤、两部阴离子交换层析方法收集上清液,对重组葡激酶-水蛭素融合蛋白进行分离纯化,观察其纤溶比活性及在菌体中的高效表达价值。结果与结论:发酵培养工程菌,并在第17小时时予以诱导。结果发现,诱导0.5 h时,便能观察到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,且发酵时间越长重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达量相应越大;至发酵20 h时,表达达到顶峰。菌体干质量为32.20 g/L,目的蛋白表达量约为1.48 g/L。经过纯化处理后,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯度高达98%,纤溶比活性约为2.6×104 IU/mg,回收活性的概率为56%。实验通过构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并分析其表达价值,提示该纯化工艺较为便捷,耗时较短,且能重复使用,可用于大规模生产。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2015年20期）
薛晓莹[8]（2015）在《葡激酶的聚乙二醇定点修饰产物制备及药学性质研究》一文中研究指出聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰可有效地提高蛋白质药物在体内的循环半衰期、降低药物对蛋白水解酶的敏感性和免疫原性。葡激酶(staphylokinase,SAK)是一种可用于治疗心肌梗死的新型溶栓制剂,它的作用底物纤溶酶原是一种生物大分子。SAK的体内循环半衰期较短,并且对人体具有较强的免疫原性,PEG修饰技术可以很好地解决葡激酶存在的这些临床缺陷。但是,PEG分子对蛋白质表面的空间屏蔽作用会影响蛋白质药物与其底物的相互作用,从而引起蛋白质药物的生物活性降低,这一问题在以生物大分子为作用底物的蛋白质药物中尤为严重。本研究以SAK作为模型蛋白,通过调节PEG与SAK之间的连接桥,改变PEG的构象及其对蛋白质的空间屏蔽效应,以期找到一种提高PEG化蛋白质生物活性的方法。选择远离蛋白质的活性区域进行定点修饰是降低PEG分子对蛋白质活性影响的有效方法。本论文中所使用的SAK为重组蛋白,在远离其活性区域的C-末端引入了半胱氨酸残基。然后,通过3种不同的异型双功能小分子分别将一个PEG-20K共价连接在SAK的C-末端自由巯基上。制得的3种单一定点PEG化SAK具有基本相同的结构,唯一的差别在于PEG分子与SAK之间的连接桥。这3种连接桥为苯基、丙基和戊基,其中苯基代表刚性结构,丙基和戊基代表柔性结构(丙基和戊基可被视为不同长度的柔性结构)。圆二色光谱和荧光光谱检测结果表明,在这3种PEG修饰产物中,SAK蛋白质本身的结构均未发生明显变化。动态光散射和分析超离心检测结果显示刚性连接桥介导形成致密的PEG构象,PEG以紧致的结构覆盖于修饰位点附近；而柔性连接桥可介导形成疏松的PEG构象,PEG可以舒展地覆盖于SAK的表面。对于远离活性中心修饰的SAK,局部致密的PEG构象对SAK的空间屏蔽效应较小。对修饰产物的药学性质进行研究,发现局部致密的PEG构象既能有效地提高蛋白质的循环半衰期,降低药物对蛋白水解酶的敏感性和免疫原性,同时能更大限度地保持蛋白质的体外生物活性(比延展疏松的PEG构象高15%)本研究进一步制备了6种SAK的单PEG修饰产物,分别涉及到了PEG的链长、修饰位点和PEG与蛋白质之间的连接桥这3种影响PEG修饰蛋白质的因素。将修饰产物在70℃下加热孵育2 h,进一步研究了PEG的构象及其与蛋白质的生物活性之间的关系。圆二色光谱和荧光光谱检测结果表明,较高的PEG分子量、远离活性区域、延展疏松的PEG构象在保护蛋白质结构方面更具优势。分析超离心研究结果显示加热作用使得PEG构象由延展疏松变为局部致密。这种构象转变使得通过戊基连接桥介导的PEG-20K修饰SAK产物中的PEG活性区域的屏蔽效应变小,相对生物活性升高(～27%)。这个结果进一步说明了局部致密的PEG构象可降低PEG对蛋白质药物的空间屏蔽效应,提高PEG化蛋白质药物的生物活性。本研究的修饰策略可对其它以生物大分子为作用底物的蛋白质药物的PEG修饰方法提供借鉴。(本文来源于《中国科学院研究生院(过程工程研究所)》期刊2015-05-01）
徐华,徐昕,杨进国,杨剑,曾文强[9]（2015）在《抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建与表达》一文中研究指出目的:探讨抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建效果与抗凝溶栓活性表达情况。方法:在间接实验中,选择p BV-重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质质粒进行酵母大量表达,再进行两级纯化分析;去纯化的单位进行抗凝溶栓的检测。结果:工程菌酵母发酵培养诱导1 h后就可以检测到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,表达量随发酵时间的增加而递增。两级纯化的重复性非常好,纯度经RP-HPLC测定在98%以上。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的溶栓活性明显高于水蛭素与葡激酶的单纯溶栓活性(P<0.05)。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白具有更强的纤溶酶原激活活性,明显高于水蛭素与葡激酶的单纯纤溶酶原激活活性(P<0.05)。结论:重组葡激酶-水蛭素融合蛋白生产工艺具有很好的诱导与纯化效果,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白能发挥较好的抗凝与溶栓作用。(本文来源于《内科急危重症杂志》期刊2015年02期）
苟冶然[10]（2015）在《葡激酶研究进展》一文中研究指出葡激酶(staphylokinase,SAK)作为新一代溶栓制剂,是由金黄色葡萄球菌合成的一种蛋白质,具有极大的临床应用前景：其不仅具有高效的溶栓活性和纤维蛋白特异性,而且在溶解血栓的过程中血纤维蛋白原降解少,不会引起全身纤溶亢进。进入机体后引起的免疫反应和溶栓后再梗塞是限制其临床使用的主要原因,近年来生物工程技术的发展为解决这两大问题提供了新的重要途径,为临床新一代溶栓药物的研究带来希望。本文将就葡激酶的分子结构特点、溶栓活性及机理、免疫原性改造等方面的研究进展作一系统综述。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2015-04-01）
葡激酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的通过对葡激酶(SAK)基因序列进行定点突变、表达、纯化与进行聚乙二醇修饰以获得较高纯度的聚乙二醇化葡激酶(peg-SAK-cys),并对其溶栓活性与免疫原性初步进行验证。方法设计引物将根据SAK晶体结构与预测抗原位点所挑选的82号氨基酸突变为半胱氨酸并将突变质粒通过化学转化进入BL21(DE3)感受态。利用经典原核表达技术表达突变葡激酶蛋白(SAK-cys)。利用镍离子交换柱、分子筛等方法分离纯化SAK-cys蛋白并对其进行聚乙二醇修饰。用纤维蛋白平板溶圈法和血栓弹力图初步对本次实验制备的peg-SAK-cys与课题组以相同方法制备的另外4种peg-SAK-cys的生物活性进行验证。以酶联免疫吸附(ELISA)法评价这些peg-SAK-cys的免疫原性。分析体外实验数据,并对功能评价较高的peg-SAK-cys通过动物栓塞实验模型进一步功能验证。结果成功获得了82号氨基酸突变的葡激酶质粒,表达、纯化了突变蛋白,并进行聚乙二醇修饰获得了第82号葡激酶突变的葡激酶蛋白(peg-SAK-C82A),分离纯化后纯度在总蛋白质量的90%以上。统计分析与计算溶圈实验结果,第97号与104号氨基酸突变的聚乙二醇化葡激酶(peg-SAK-C97A、peg-SAK-C104G)保留了较高的活性;血栓弹力图实验数据也支持了这一结果;免疫原性测定结果提示peg-SAK-C104G的免疫原性显着低于野生型SAK(P=0.0002);评价peg-SAK-C104G对SD大鼠颈动脉栓塞模型的溶栓效果,显示蛋白于体内实验也保留了相当的溶栓能力。结论通过位点特异性特变与聚乙二醇修饰技术的联合运用可以成功改造出有较低免疫原性的活性葡激酶。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
葡激酶论文参考文献
[1].祁芳冰.基于八臂PEG聚集和阿拉伯半乳聚糖-PEG修饰的长效葡激酶及其药学性质研究[D].中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所).2019
[2].徐彦颖.新型聚乙二醇化葡激酶的制备及功能鉴定研究[D].重庆医科大学.2017
[3].徐彦颖,白垒,汪德强,周建中.新型聚乙二醇化葡激酶的表达、纯化及功能鉴定研究[J].中国新药与临床杂志.2017
[4].白垒,徐彦颖,汪德强,周建中.葡激酶聚乙二醇修饰及活性鉴定研究[J].重庆医科大学学报.2017
[5].白垒.葡激酶改造：定点突变与聚乙二醇修饰联合应用及初步功能验证[D].重庆医科大学.2016
[6].董耘,徐昕,李斌,柯丽娜,陈武.重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外的抗凝溶栓作用分析[J].血栓与止血学.2015
[7].徐华,董耘,杨进,刘少帮,刘少华.重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建表达[J].中国组织工程研究.2015
[8].薛晓莹.葡激酶的聚乙二醇定点修饰产物制备及药学性质研究[D].中国科学院研究生院(过程工程研究所).2015
[9].徐华,徐昕,杨进国,杨剑,曾文强.抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建与表达[J].内科急危重症杂志.2015
[10].苟冶然.葡激酶研究进展[D].重庆医科大学.2015
论文知识图
