口蹄疫病毒2B、3B蛋白对RLRs介导的Ⅰ型干扰素抑制作用研究

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种猪、牛、羊等偶蹄动物急性、高度传染性的疾病。鉴于口蹄疫能够对畜牧业生产造成严重经济损失,世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病,在我国为一类动物疫病。当前研究已证实FMDV编码的非结构蛋白Lpro、3A、3Cpro,和结构蛋白VP1等具有抑制宿主先天性免疫应答的特性,但非结构蛋白2B、3B是否在抑制宿主天然免疫应答中发挥作用尚属未知。因此本研究主要对FMDV 2B、3B在天然免疫应答过程中的作用开展研究,以期阐明其在RIG-Ⅰ样受体（RIG-Ⅰ like receptors,RLR）介导的Ⅰ型干扰素应答中是否具有抑制作用及其作用机制。本研究利用反转录实时定量PCR（RT-qPCR）和双荧光素酶报告基因实验发现FMDV 2B能显著降低HEK293T细胞中IFN-β、IL-6、ISG15的mRNA水平,并且能够显著抑制由Poly（I:C）诱导或SeV触发的IFN-β、NF-κB、ISRE启动子的激活,结果表明2B能抑制Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子的转录激活。为探究FMDV 2B通过何种机制抑制HEK293T细胞中RLR介导的Ⅰ型干扰素应答,通过磷酸化检测发现FMDV 2B过表达后能抑制HEK293T细胞中TBK1和IRF3的磷酸化水平;免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）和Pull-Down实验结果表明FMDV 2B可与RIG-Ⅰ样受体RIG-Ⅰ、MDA5相互作用;此外,在HEK293T细胞中过表达2B后发现,FMDV2B能抑制RIG-Ⅰ、MDA5的转录水平,并能够抑制外源性和内源性RIG-Ⅰ、MDA5在蛋白水平表达,但不抑制VISA、TBK1、IRF3的表达。本研究还发现在HEK293T细胞中过表达FMDV 3B能显著抑制IFN-β、IL-6、ISG15的转录,并降低由Poly（I:C）诱导或SeV触发的IFN-β、NF-κB、ISRE启动子的激活。双荧光素酶报告基因实验表明,FMDV 3B在RIG-Ⅰ和MDA5水平调节RLR介导的Ⅰ型干扰素应答;RT-qPCR实验结果显示FMDV 3B过表达能下调RIG-Ⅰ、MDA5的转录水平。同时,我们发现FMDV 3B1/3B2/3B3三种蛋白均能抑制HEK293T细胞中Ⅰ型干扰素相关启动子的活化。综上所述,本研究发现FMDV 2B能与RIG-Ⅰ和MDA5相互作用,并抑制RIG-Ⅰ和MDA5的转录、表达;此外,FMDV 2B能抑制RLR信号通路中TBK1和IRF3的磷酸化,从而抑制Ⅰ型干扰素的表达。另外,FMDV 3B对HEK293T细胞中的Ⅰ型干扰素应答也具有抑制作用,并且FMDV3B1/3B2/3B3三种蛋白均能够抑制Ⅰ型干扰素相关启动子的活化。本研究结果可以进一步提高我们对FMDV逃避宿主免疫系统机制的理解,同时也为开发新型口蹄疫疫苗以及制定更加有效的口蹄疫防控策略提供借鉴。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
•   1.1 RLRS模式识别受体研究进展
•     1.1.1 维甲酸诱导基因Ⅰ
•     1.1.2 黑色素瘤分化相关因子5
•     1.1.3 遗传学和生理学实验室蛋白2
•   1.2 口蹄疫简介
•     1.2.1 口蹄疫病毒基因组结构特征
•     1.2.2 口蹄疫病毒的前体蛋白酶
•     1.2.3 口蹄疫病毒的结构蛋白
•     1.2.4 口蹄疫病毒的非结构蛋白
•   1.3 口蹄疫病毒拮抗宿主的抗病毒反应
•     1.3.1 FMDV的前体蛋白在免疫逃逸中的研究进展
•     1.3.2 FMDV的结构蛋白在免疫逃逸中的研究进展
•     1.3.3 FMDV的非结构蛋白在免疫逃逸中的研究进展
•   1.4 研究目的和意义
• 第二章 口蹄疫病毒2B蛋白抑制Ⅰ型干扰素相关因子的转录激活
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 细胞、病毒和质粒
•     2.1.2 主要试剂和耗材
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 相关溶液和试剂的配制
•     2.1.5 重组质粒的构建
•     2.1.6 重组质粒的表达鉴定
•     2.1.7 反转录实时定量PCR检测2B蛋白对IFN-β、IL-6、ISG15 转录的影响
•     2.1.8 双荧光素酶报告实验检测2B蛋白对IFN-β、NF-κB、ISRE启动子的影响
•     2.1.9 重组表达质粒的剂量依赖性检测
•   2.2 实验结果
•     2.2.1 pEGFP-C1-2B重组质粒的构建
•     2.2.2 重组质粒的表达鉴定
•     2.2.3 FMDV2B抑制由Poly（I:C）或SeV介导的IFN-β、IL-6、ISG15转录水平
•     2.2.4 FMDV2B抑制由Poly（I:C）或SeV介导的IFN-β、NF-κB、SRE启动子的激活
•     2.2.5 HEK293T细胞中Poly（I:C）介导的Ⅰ型干扰素与pEGFP-C1-2B转染剂量负相关
•     2.2.6 HEK293T细胞中SeV介导的Ⅰ型干扰素与pEGFP-C1-2B转染剂量负相关
•   2.3 讨论
• 第三章 口蹄疫病毒2B蛋白对RLRS通路的抑制作用研究
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 细胞、病毒和质粒
•     3.1.2 主要试剂和耗材
•     3.1.3 主要仪器
•     3.1.4 相关溶液和试剂的配制
•     3.1.5 RLR通路基因重组质粒的构建
•     3.1.6 FMDV2B对TBK1和IRF3磷酸化的影响
•     3.1.7 FMDV2B对外源性RLRs通路分子表达的影响
•     3.1.8 FMDV2B对内源性RLRs通路分子表达的影响
•     3.1.9 免疫共沉淀检测FMDV2B与外源性RLRs通路分子的相互作用
•     3.1.10 Pull-Down检测FMDV2B与内源性RLRs通路分子的相互作用
•   3.2 实验结果
•     3.2.1 RLRs通路重组质粒的构建
•     3.2.2 FMDV2B抑制TBK1和IRF3的磷酸化
•     3.2.3 FMDV2B抑制外源性RIG-Ⅰ和MDA5的表达
•     3.2.4 FMDV2B抑制内源性RIG-Ⅰ和MDA5的表达
•     3.2.5 FMDV2B与外源性RIG-Ⅰ和MDA5发生相互作用
•     3.2.6 FMDV2B与内源性RIG-Ⅰ和MDA5发生相互作用
•   3.3 讨论
• 第四章 口蹄疫病毒3B蛋白对RLRS通路调控的初步研究
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 细胞、病毒和质粒
•     4.1.2 主要试剂和耗材
•     4.1.3 主要仪器
•     4.1.4 相关溶液和试剂的配制
•     4.1.5 重组质粒的构建
•     4.1.6 重组质粒的表达鉴定
•     4.1.7 反转录实时定量PCR检测3B蛋白对IFN-β、IL-6、ISG15 转录的影响
•     4.1.8 双荧光素酶实验检测3B蛋白对IFN-β、NF-κB、ISRE启动子的影响
•     4.1.9 FMDV3B调节RLR信号通路靶向分子的初步鉴定
•     4.1.10 FMDV3B对 RLR通路分子mRNA表达的影响
•     4.1.11 FMDV3B1/3B2/3B3蛋白对IFN-β、NF-κB、ISRE启动子的影响
•   4.2 实验结果
•     4.2.1 pEGFP-C1-3B和pEGFP-C1-3B1/3B2/3B3重组质粒的构建
•     4.2.2 重组质粒的表达鉴定
•     4.2.3 FMDV3B抑制由Poly（I:C）或SeV介导的IFN-β、IL-6、ISG15 转录水平
•     4.2.4 FMDV3B抑制由Poly（I:C）或SeV介导的IFN-β、NF-κB、ISRE启动子的激活
•     4.2.5 FMDV3B在 RIG-Ⅰ和MDA5水平调节RLRs通路
•     4.2.6 FMDV3B抑制RIG-Ⅰ和MDA5分子mRNA的表达
•     4.2.7 FMDV 3B1/3B2/3B3 蛋白均能抑制IFN-β、NF-κB、ISRE启动子的激活
•   4.3 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李明

导师: 崔尚金

关键词: 口蹄疫病毒,先天性免疫,样受体,型干扰素

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家重点研发计划(No:2017YFD0502302,2017YFD0500906,2017YFD0500902),国家自然科学基金(No.31402232)

分类号: S852.65

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