一、融合表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和卵清白蛋白CD8~+T细胞表位的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定（论文文献综述）
郭恒[1]（2011）在《利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究》文中研究说明狂犬病（Rabies）是由狂犬病毒（Rabies virus,RV）引起的可导致高致死率的危害严重的人兽共患病。我国人的狂犬病主要由患病犬咬伤或通过粘膜接触所致,对犬群的大规模免疫接种是控制狂犬病的最佳途径。目前我国使用的兽用狂犬病疫苗主要弱毒活疫苗及灭活细胞培养疫苗两种,前者在使用过程中存在毒力返祖的安全隐患,国际上对家养动物禁用狂犬病活疫苗;而后者主要依靠进口,供应量不足、价格昂贵,无法满足我国目前大规模免疫接种的需求。2010年我国农业部虽然批准首个灭活国产兽用狂犬病疫苗可以进行生产,但目前尚无价格低廉的产品上市。同时上述两种疫苗采用多次注射进行免疫,免疫程序繁冗,使用不便,限制在野生动物及犬群中的使用。沙门氏菌（Salmonella）血清型繁多,是人兽共患病原菌,其中鼠伤寒菌（Salmonella Typhimurium）对小鼠及犬类动物均易感。沙门氏菌为细胞内寄生菌,具有黏膜组织或抗原提呈细胞的亲嗜性,可经口服粘膜自然感染途径将重组基因直接呈送给抗原递呈细胞,有刺激抗原特异性体液和细胞免疫、诱导细胞凋亡的功能,含自身佐剂CpG基序,是最早用作活疫苗载体实验模型的工具菌之一,也是目前遗传背景最清楚、应用最广泛的活菌疫苗载体。减毒沙门氏菌携带异种抗原运送效率高、免疫方法简单、激发免疫应答全面,至今已介导40余种的病毒、细菌、寄生虫和与肿瘤治疗相关基因的表达。狂犬口服免疫具有简便、易行、群众易接受的特点,适合对犬群及野生动物的大规模免疫,口服免疫也是世界各国学者推崇的有效接种途径。狂犬病毒糖蛋白（glycoprotein,GP）是激发中和抗体的唯一有效抗原,而核蛋白（nucleoprotein,NP）可激发细胞免疫应答,促进中和抗体的产生。为此,本研究构建了以沙门氏菌为运载体携带狂犬病毒GP基因和NP基因的新型口服疫苗新型口服疫苗,进行了如下系列实验研究:1.为增强构建质粒的稳定性,PCR方法扩增pBR322克隆载体中rop基因调控片段定向插入pVAX1载体中,构建中低拷贝真核表达载体pR。Realtime PCR显示改造后的pR载体较pVAX1拷贝数降低约13倍。RT-PCR法扩增中国狂犬病毒人用疫苗株CTN-1的GP和NP基因,基因重组技术分别克隆至pVAX1载体中构建单基因表达载体pV-G和pV-N;重叠PCR法将破伤风毒素C片段（Tetanus Toxin Fragment C,TTc）与GP基因串联,两基因间设（G4S）2柔性linker,构建双基因串联融合表达载体pV-GT和pR-GTTc。构建的2个串联表达载体转染BHK-21细胞,间接免疫荧光及Western blot检测到融合蛋白的表达。2.构建的pV-G、pV-N、pV-GT、pR-GT真核表达质粒电转化入鼠伤寒沙门氏菌phoP/phoQ疫苗株（简称PQ）中,分别构建重组沙门氏菌PQ-VG、PQ-VN、PQ-VGT和PQ-RGT。重组菌体外无抗生素下连传100代,PQ-RGT中质粒滞留率较PQ-VGT高18%。于第1、3、14天以1x1010CFU剂量重组菌口服免疫11-13g雌性昆明鼠,末次免疫35天后发现PQ-RGT和PQ-VN联合免疫组可抵抗12 LD50的CVS-24脑内致死性攻击,小鼠的保护率为65%,明显优于PQ-VG、PQ-VGT、PQ-RGT的单一细菌免疫组（保护率分别为25.0%、33.3%和43.8%）及PQ-VGT、PQ-VN混合免疫组（53.3%）。所有接种PQ的对照鼠CVS-24脑内攻击后3-14天内均出现典型狂犬病症状并最终死亡。3.为增强外源蛋白在沙门氏菌中表达的稳定性,以原核低拷贝克隆载体pGB2为基础进行构建重组表达载体。选取GP中含多个线性表位的179-281aa肽段（命名为Gepi）化学合成沙门氏菌偏嗜性密码子优化后的肽段Gopt。克隆丁香假单胞菌的冰核蛋白的N端截短区（INPn）和沙门氏菌PQ的体内厌氧诱导启动子PnirB及强转录终止子序列rrnbT1T2,根据特异酶切位点的粘性末端体外按PnirB、INPn、Gopt和rrnbT1T2顺序连接构建重组表达载体pGnirB-I-Gopt及未进行密码子优化的重组载体pGnirB-I-Gepi。重组质粒经电转化转入PQ中并分别命名为PQ-IGO和PQ-IG。菌落印迹和间接免疫荧光显示重组菌可经厌氧诱导肽段的表达,并可将其展示于细菌表面。重组菌PQ-IGO用于PQ-RGT和PQ-VN联合免疫组的第3次的prime-boost,小鼠保护率为75.0%,略低于商品化疫苗腹腔注射prime-boost加强组,优于之前的非prime-boost免疫组及未进行密码子优化组。4.重组菌联合免疫激发的抗狂犬病毒中和抗体、抗破伤风毒素及沙门氏菌IgG,细胞因子IL2、INFγ以及Treg调节T细胞和CD4+CD8+T细胞含量等被检测,结果表明三种质粒联合应用可有效诱发针对狂犬、破伤风毒素及沙门氏菌的多价体液和细胞免疫应答,并可对75%以上的小鼠产生保护。本实验成功构建了以减毒伤寒菌为运载体的兼顾破伤风梭菌及鼠伤寒沙门氏菌免疫防治的多价狂犬病口服疫苗的实验模型。我国犬数量庞大,种群增殖快,并且交易频繁。由于目前狂犬病流行的自然宿主还不十分清楚,野生动物狂犬病疫情病原流行病学调查数据还不详实,新型口服狂犬病疫苗的研发将对深化我国狂犬病免疫防治现状具有重要意义。本课题以减毒伤寒菌为运载体,为安全有效的适合犬、猫及野生动物使用的新型暴露前预防性口服疫苗的研究奠定了基础。国内相关研究多为病毒活载体疫苗及基于反向遗传技术的弱毒活疫苗,本研究的成功可为狂犬口服疫苗的研制提供一种成本更加低廉的备选方案。
赵红妮[2]（2011）在《表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建及动物免疫试验》文中指出本研究目的旨在构建一种表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗,通过动物免疫试验对构建的疫苗进行评价。Cap蛋白是PCV2 ORF2基因编码的主要结构蛋白和免疫保护性蛋白,本研究选择截去N端41个氨基酸的核定位区的ORF2编码基因作为目的基因,利用减毒鼠伤寒沙门氏菌的平衡致死系统表达优化的ORF2基因,构建表达Cap蛋白的活载体疫苗,并对重组菌苗的生物学特性和免疫学特性进行评价。研究取得如下结果:1表达猪圆环病毒Cap蛋白的鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建合成特异性引物P1、P2,PCR扩增得到ORF2基因,将其插入经BamH I和Pst I双酶切的Asd+的组成型表达载体pYA3341中,构建重组表达载体pYA3341-ORF2;重组载体电转化入缺失天冬氨酸-β-半醛脱氢酶（Δasd）、腺苷酸环化酶（Δcya）以及环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）的减毒鼠伤寒沙门氏菌中间宿主菌X3730及终末宿主菌X4550中,获得重组活载体疫苗菌X4550（pYA3341-ORF2）。2重组活载体疫苗菌的生物学特性检测研究重组活载体疫菌苗X4550（pYA3341-ORF2）体外稳定特性、生长特性、口服安全性及在小鼠体内的定值分布情况。结果显示,Cap蛋白能在X4550中有高水平的表达,且重组菌能在体外稳定遗传、生长状态良好、口服安全无毒性及在机体中具有良好的定值分布特性。3重组活载体疫苗菌的免疫原性研究将重组活载体疫苗菌X4550（pYA3341-ORF2）口服免疫Balb/C小鼠作为免疫组,以口服重组菌X4550（pYA3341）的小鼠作为阴性对照组,以口服PBS的小鼠作为空白对照组。ELISA方法检测疫苗免疫组小鼠血清抗体效价达到1:1920;间接免疫荧光法检测疫苗免疫组小鼠血清中和抗体效价可达到1:19.2;MTT法检测免疫组小鼠淋巴细胞分裂指数可达到4.26;流式细胞术检测疫苗免疫组小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目分别约为29.9、7.52,CD4+/CD8+T细胞比值约为3.99。将重组活载体疫苗菌X4550（pYA3341-ORF2）免疫猪,ELISA法检测疫苗免疫猪血清抗体效价1:57.6;疫苗免疫组猪血清的中和抗体效价可达到1:11.2;疫苗免疫组淋巴细胞分裂指数可达到3.82。重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）能够稳定表达Cap蛋白,具有良好免疫原性,为该疫苗的进一步研制与临床应用提供参考依据。
朱向莹[3]（2010）在《减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的抗原递呈系统在肿瘤治疗性口服DNA疫苗及蛋白质疫苗制备中的应用》文中指出治疗性疫苗能够打破免疫耐受并引起针对癌症细胞的长时程免疫反应,由于疫苗给药途径与构建有效的抗原递呈系统是疫苗制备需要解决的关键性问题。减毒鼠伤寒沙门氏菌作为癌症疫苗的载体能够将DNA从原核细胞传递至真核细胞,并且能够选择性积聚在肿瘤组织。热休克蛋白70能够通过其多肽结合结构域与抗原结合并与抗原递呈细胞表面的Hsp70受体作用,将抗原传递至抗原递呈细胞。本论文的第一部分,我们构建了一种新型的低拷贝DNA疫苗,该疫苗基于Hsp70-TAA复合物构建,并由减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261菌株作为载体将DNA运送至小鼠体内。口服该重组细菌疫苗能够诱发针对黑色素肿瘤细胞的CTL细胞毒性细胞杀伤作用并显着激活T细胞反应。在肿瘤预防实验组C57BL/6J小鼠模型中,该治疗性口服疫苗能够诱发57.1%的肿瘤预防免疫反应,在肿瘤治疗组中,该疫苗能够完全消除62.5%的C57BL/6J小鼠中B16F10肿瘤的生长,显着延长小鼠的生存期。口服减毒沙门氏菌疫苗载体通常定位在吞噬性细胞中,限制了其所携带的抗原蛋白进入抗原递呈途径,论文的第二部分我们利用沙门氏菌Ⅲ型分泌系统对蛋白质的转运功能来克服这种限制。Ⅲ型分泌蛋白能够将沙门氏菌编码的抗原蛋白直接运送至抗原递呈细胞胞质。抗原递呈细胞表面存在Hsp70的特异性受体,故Hsp70能够以Hsp70-TAA复合物的形式向APC细胞递呈抗原。本研究利用Ⅲ型分泌系统来实现对Hsp70-TRP2融合抗原蛋白的转运和递呈。口服该重组细菌疫苗能够实现对肿瘤特异性抗原的有效递呈,打破免疫耐受,诱导产生肿瘤细胞特异性的CTL反应和NK细胞杀伤作用,并在C57BL/6J小鼠上建立的B16F10黑色素肿瘤模型中获得了75%的肿瘤预防效果和62.5%的治疗效果。我们设计了以减毒鼠伤寒沙门氏菌作为肿瘤DNA疫苗及蛋白疫苗的传递工具的两套抗原递呈系统,为肿瘤的预防和治疗提供了有效的新方法。
陈晓娟[4]（2009）在《减毒鸡伤寒沙门氏菌△asd缺失株的构建及其携带外源基因的表达》文中研究说明沙门氏菌是一种非常重要的人兽共患病病原菌,主要引起人和动物的发热、肠炎、败血症等多种疾病症状,呈全球性分布。沙门氏菌为胞内侵袭性细菌,能有效呈递抗原,激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液免疫与细胞免疫,并能同时诱导黏膜免疫与全身免疫。近几年,沙门氏菌常通过宿主载体平衡致死系统构建新型疫苗载体。减毒鸡伤寒沙门氏菌疫苗株97A是经转座突变及粗糙变异筛选所获得,本实验室已从安全性、免疫效力和病理组织学等各个方面对97A疫苗株作出评价,研究结果表明,该减毒株具有较好的安全性和免疫效力。本研究旨在研制更加安全的减毒鸡伤寒沙门氏菌97A疫苗株,并将其开发为新型活疫苗载体。以97A为亲本菌,缺失基因组中编码天冬氨酸-β-半乳糖脱氢酶的asd基因,构建asd宿主载体平衡致死系统,用于高效表达外源基因,初步应用该系统表达了红色荧光蛋白基因和新城疫F蛋白基因部分片段,为研制新型载体疫苗奠定了基础。1.减毒鸡伤寒沙门氏菌97A△a sd缺失株的构建与鉴定为了研制更加安全的鸡伤寒沙门氏菌弱毒株,并使其开发为活疫苗载体,本研究构建了鸡伤寒沙门氏菌97A△asd缺失株,并以此建成宿主载体平衡致死系统。根据鸡伤寒沙门氏菌asd基因已发表的基因序列,设计并合成了2对引物,PCR方法扩增了asd上下游序列。通过氯霉素抗性基因替代asd基因中间片段,构建重组自杀性质粒,与鸡伤寒沙门氏菌野生菌接合转移,两步法筛选△asd缺失株。结果表明,△asd缺失株被成功构建,命名为97A△asd缺失株,其表型、生长特性及生化特征与野生菌保持一致。基因互补试验结果显示,该突变株能稳定表达红色荧光蛋白,即该宿主载体平衡致死系统能高效表达外源基因,为鸡伤寒沙门氏菌载体疫苗的进一步研究奠定了基础。2.新城疫病毒F基因部分片段在减毒鸡伤寒沙门氏菌97A△a sd缺失株中的表达以重组质粒pVAX1-F为模板扩增594 bp的NDV-F基因部分片段,亚克隆至原核表达质粒pYA3334中,获得X6212（pYA3334-F）。从大肠杆菌X6212提取重组质粒pYA3334-F,并将其电转化沙门氏菌中间宿主X3730进行甲基化处理,最后将甲基化的原核表达质粒pYA3334-F电转化X4550,SDS-PAGE电泳和免疫试验检测到F表达。将验证正确的重组质粒pYA3334-F电转化97A△asd缺失株,SDS-PAGE电泳检测F表达。携带F的重组菌97A（pYA3334-F）及对照菌97A（pYA3334）以1×109 CFU/只肌注免疫雏鸡,结果表明该重组菌是安全的,免疫组产生了针对F蛋白的IgG抗体,二免二周平均抗体效价至1:200,三免二周平均抗体效价至1:400。上述结果为进一步研制新城疫新型疫苗奠定了基础。
丁军涛[5]（2008）在《表达Tsol18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建及其免疫学研究》文中研究说明囊尾蚴病（Cysticercosis）是由猪带绦虫（Taenia solium）的幼虫囊尾蚴（Cysticercus cellulosae）寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。囊尾蚴病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,严重威胁着人体健康,不仅如此,猪囊尾蚴病的广泛存在极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行,然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。Tsol18是猪带绦虫六钩蚴（T.solium oncosphere）阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴感染中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外试验中能杀死六钩蚴,是猪囊尾蚴病疫苗研制的主要候选抗原之一。在已有的研究中,Tsol18重组蛋白在原核系统中多以包涵体形式表达,给蛋白质的复性和纯化带来许多困难,并且包涵体活性较低、保存期短、降解快,因而限制了Tsol18在猪囊尾蚴病疫苗研制上的应用。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显着降低,但仍保留良好的侵袭力,可将免疫抗原直接递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反应,减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗载体是目前疫苗免疫研究的热点之一。为了优化猪囊尾蚴病疫苗候选抗原Tsol18重组蛋白,探索猪囊尾蚴病口服重组活载体疫苗的免疫应答,研究其在猪囊尾蚴病免疫预防上的作用,进行了本项研究。收集成熟的猪带绦虫虫卵,经孵化和激活后,提取六钩蚴总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增Tsol18基因片段,并同义突变Tsol18基因片段中四个大肠杆菌低利用率密码子,截去其N端的16个氨基酸的信号肽编码序列,构建原核表达载体pGEX-4T-Tsol18并表达,进行GST-Tsol18重组蛋白的SDS-PAGE、Western blot及稳定性分析,并以GST-Tsol18重组蛋白为抗原制备兔高免血清;将改造的Tsol18基因片段插入Asd+的组成型表达载体pYA3341,构建重组载体pYA3341-Tsol18,将重组载体电转化入缺失腺苷酸环化酶（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸-β-半醛脱氢酶（Δasd）的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,研究重组活载体疫苗X4550（pYA3341-Tsol18）表达Tsol18重组蛋白的免疫原性、生长稳定性、口服安全性及在小鼠体内的分布情况,ELISA检测免疫小鼠血清和肠液中抗Tsol18抗体的产生情况,流式细胞术分析其脾细胞亚型的分化,ELISA检测免疫猪血清中抗Tsol18抗体的动态变化,探讨重组疫苗可能的免疫应答。结果显示改造后的GST-Tsol18重组蛋白多以可溶性形式表达,蛋白表达量占菌体总蛋白的24 %,Western blot证明GST-Tsol18重组蛋白具有良好的抗原性,4℃保存120 d只有20.1 %降解,显示重组蛋白稳定性有很大改善。重组疫苗4550（pYA3341-Tsol18）在没有选择压力的情况下连续培养100代后,随机挑选的重组疫苗株全部都能生长和表达Tsol18重组蛋白,表明重组疫苗生长稳定;BALB/c鼠口服重组疫苗株2.0×1012 cfu 30天后,存活率100 %,证实重组疫苗口服安全可靠,小鼠口服免疫后第21天在脾脏仍能测到大量的重组疫苗株,表明重组疫苗在体内能够长久存活,有利于刺激机体产生持久的免疫应答;ELISA检测显示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18 IgG抗体的OD值达到0.645,二免后六周小鼠肠液中有抗Tsol18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种免疫应答方式;免疫小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目明显增多,CD4+/CD8+ T细胞比值也显着增高（P<0.01）,提示口服疫苗4550（pYA3341-Tsol18）可能同时诱导Th1和Th2免疫应答反应。猪免疫后20 d抗Tsol18 IgG抗体水平开始上升,在二免后30天抗体OD值达到1.025,表明重组疫苗能诱导猪产生抗猪囊尾蚴病的免疫应答效应。本研究获得了具有高效表达、良好免疫原性和稳定性的猪囊尾蚴病疫苗候选抗原GST-Tsol18重组蛋白,构建了携带Tsol18重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗4550（pYA3341-Tsol18）,初步进行了重组疫苗的免疫学研究,为猪囊尾蚴病基因工程疫苗的研制和应用开拓了新的思路。
杨冬梅[6]（2007）在《大肠杆菌K88ac-ST Ⅱ融合基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达与免疫》文中研究说明为了构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和热稳定肠毒素STII融合基因的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,并对其免疫效果进行研究。根据GenBank中登录号为m29375的K88ac基因序列以及减毒鼠伤寒沙门氏菌原核表达载体pYA3334的多克隆位点设计特异性引物P1、P2,并在上下游引物的5’端分别引入NcoI和BamHI酶切位点,从大肠杆菌DE3（pET- K88ac-STⅡ）中通过聚合酶链式反应（PCR）扩增得到K88ac-STⅡ融合基因。回收纯化后将K88ac-STⅡ融合基因用T4DNA连接酶连于克隆载体pBS-T上,热击转化受体大肠杆菌Top10,蓝白斑筛选阳性菌落,酶切鉴定证明其中含有K88ac-STⅡ融合基因片段,再测序鉴定该融合基因序列的正确性,命名为pBS-K88ac-STⅡ。之后采用缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因（Δasd）的鼠伤寒沙门氏菌（X4550）作为宿主,将编码K88ac-STII的融合基因切下插入Asd+组成型表达载体pYA3334中,鉴定后通过电转化引入宿主菌X4550中,再次酶切鉴定正确后,过夜培养进行SDS-PAGE和Western-Blot试验,检测其特异性蛋白表达情况。最后分别以重组菌株X4550（pYA3334-K88ac-STII）灌服小鼠作为试验组,以转化了空载体的菌株X4550（pYA3334）作为空载体对照组,同时设PBS空白对照组,分别对三个分组的小鼠进行免疫,采集血清检测其抗体效价,之后免疫小鼠用强毒株C83915（STⅡ﹢）攻击,观察结果。本实验成功构建了表达K88ac-STII融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门氏重组菌株X4550（pYA3334-K88ac-STII）,该重组菌株在33Kda处有特异性表达的蛋白条带,与预期分子量大小一致,而空载体对照菌X4550（pYA3334）在该处未有相应条带出现。Western-blot免疫印迹结果显示重组菌株X4550（pYA3334-K88ac-STII）表达的蛋白能够被K88ac阳性血清特异性结合,在相应位置出现特异性显色条带。这证明重组菌株能够表达K88ac-STII特异性融合蛋白,重组菌的体外稳定实验也证明其有良好的稳定性,从而保证了K88ac-STII抗原能够得以持续表达。而且试验小鼠灌喂重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550 （pYA3334-K88ac-STII）后,能够产生特异性的抗体,而且对大肠杆菌强毒株具有一定的抵抗力。这为进一步研制相应的抗仔猪大肠杆菌病及相应的沙门氏菌病的双价活疫苗侯选株奠定了重要基础。
潘志明,张晓明,焦新安,Richard Lo-Man,Claude Leclerc,刘秀梵[7]（2006）在《重组减毒细菌运送CD8+T细胞表位的效应分析》文中认为目的:分析重组减毒菌体外运送CD8+T细胞表位的效应。方法:以表达卵清蛋白（OVA）和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）CD8+T细胞表位的重组菌13A（ptG2F）、25A（ptG2F）和SL7207（ptG2F）感染抗原提呈细胞（APC）LKb、LLd和骨髓源树突状细胞（BMDC）,应用体外抗原提呈试验检测APC对重组菌运送的CD8+T细胞表位的提呈效应。结果:感染试验证实,减毒菌13A、25A和SL7207对LKb细胞或LLd细胞均具有良好的侵袭能力,BMDC对重组菌具有很好的摄取功能。抗原提呈试验结果显示,在感染的早期（2h）,LKb、LLd细胞和BMDC均可提呈重组菌13A（ptG2F）或SL7207（ptG2F）运送的T细胞表位;在感染的晚期（48h）,LKb细胞对OVA257-264CD8+T细胞表位的提呈效应降低,LLd细胞对LCMV118-132CD8+T细胞表位的提呈效应增强。3种APC均不能提呈25A（ptG2F）运送的T细胞表位。另外,在同样的作用条件下,BMDC对减毒菌运送的抗原表位的提呈效应要强于LKb和LLd细胞。结论:重组菌能运送CD8+T细胞表位,为基于减毒细菌的新型基因工程疫苗的分子设计提供了有益借鉴。
焦红梅[8]（2006）在《减毒沙门氏菌介导的冠状病毒基因疫苗及其免疫生物学特性》文中提出确认SARS的病原体为冠状病毒以来,冠状病毒的分子生物学和免疫学的研究成为人们研究的热点之一。冠状病毒是基因组最大的RNA病毒,可感染包括人在内的多种动物。人冠状病毒229E和OC43引起10%～30%的普通感冒,其他冠状病毒可感染呼吸道、消化道和中枢神经系统等,引起猪、牛、鸡等严重的疾病,有时造成很大的经济损失。冠状病毒致病机理和免疫特性的研究还不十分深入。禽源冠状病毒-鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）,为冠状病毒属的代表,引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。减毒苗常用于预防疾病,但效果不理想且存在毒力返强的危险。为此,IB已成为养禽业最难控制的疫病之一。鼠源冠状病毒-小鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus,MHV）,可引起易感小鼠的肝炎和脑脊髓炎,可诱发中枢神经系统脱髓鞘。后者与人的中枢神经系统脱髓鞘疾病（多发性硬化症）致病机理相似。因此,中枢神经系统感染小鼠肝炎病毒可作为急性病毒性脑脊髓炎和人类脱髓鞘疾病-多发性硬化症的模型。本研究以IBV和MHV为代表,通过RT-PCR分别扩增出其S1基因和N基因,并构建了这两种基因的真核表达质粒,用减毒沙门氏菌作为运送真核表达质粒的载体,以小鼠为动物模型,探讨冠状病毒的分子免疫特性。目前现有的IB基因工程疫苗虽可诱导机体产生一定的免疫保护效应,但与传统免疫相比,还存在一定的差距。增强IBV DNA疫苗的免疫效果对于预防IB的发生已显得尤为重要。本研究在真核表达质粒pVAX1-S1的基础上,分别构建出共表达鸡IFN-γ、鸡IL-18和嵌合CpG DNA的IBV DNA疫苗,并分别将其导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌
殷月兰[9]（2006）在《产单核细胞李斯特菌减毒突变株的构建及其免疫生物学特性的研究》文中认为产单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是人兽共患李斯特菌病的病原,主要通过食用被LM污染的食品感染,能引发人的脑膜炎、发热性败血性胃肠炎、孕妇流产等,感染后发病死亡率约为25%。欧美国家曾多次暴发流行,LM对食品的污染与危害,已引起世界各国的普遍关注和高度重视,其中研制预防李斯特菌病的减毒活疫苗是重要的课题之一。另一方面,鉴于LM是胞内寄生菌,减毒LM是非常有前景的疫苗载体之一。为此,本研究通过同源重组的方式对血清型为1/2a的野生型菌株基因组中相邻的两毒力基因actA和plcB进行缺失,获得减毒重组菌株,并以减毒株开展了以原核和真核表达的不同方式运送模式蛋白GFP的研究。为了对减毒株的免疫保护力进行评价,以及从不同水平上证实基因的缺失,对毒力基因hly和actA在大肠杆菌中进行了原核表达并对ActA蛋白进行了单抗的研制。减毒突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用,而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础。此外,对于LM阐明毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件。1.产单核细胞李斯特菌actA基因和hly基因的原核表达及ActA单克隆抗体的研制利用PCR技术从血清型1/2a的LM4株中扩增出actA基因,经克隆筛选和测序鉴定后,构建成该基因的原核表达载体pGEX-6P-1-actA及pET-actA,转入终宿主菌E.coli后,IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE电泳结果表明,actA基因在两种载体中均获得表达,融合蛋白的大小分别约为120KD和97KD。
徐引弟[10]（2006）在《猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用》文中提出猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Choleraesuis）是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一，现在在我国特别是农村散养户普遍存在，造成一定经济损失。动物生前感染沙门氏菌或其产品受到污染，可使人发生食物中毒，因此该病原在公共卫生上也具有重要意义。疫苗接种是控制猪霍乱的最适宜手段。猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株，虽具有较好的免疫原性，但具有一定的残余毒力，遗传背景不清，且存在毒力返强的风险。 粘膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的主要方向。沙门氏菌作为疫苗载体已受到医学与兽医学的广泛重视，其主要优点包括沙门氏菌可以经粘膜途径免疫（口服或鼻内），操作方便，对接种对象刺激小。此外，沙门氏菌为胞内侵袭细菌，能有效呈递抗原，激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。但目前所构建的沙门氏菌载体多为鼠伤寒沙门氏菌。以猪霍乱沙门氏菌为载体的报道很少。而猪水肿病（Edema disease of swine，ED）是由某些血清型的E．coli引起的，主要发生在断乳后1—2周的仔猪，是危害断奶仔猪较严重的疾病之一。SLT—Ⅱv毒素是致水肿病的主要致病因子，由1个A亚基和5个B亚基共同组成的聚合体。A亚基为毒素的毒力部分，B亚单位决定毒素的特异性，也是毒素的主要免疫原性部分。 基于以上考虑，本研究旨在研制更加安全的猪霍乱沙门氏菌弱毒株，并将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体。以C500为亲本菌，在基因组上缺失编码cAMP受体蛋白的crp（cAMP receptor protein）基因，以降低C500毒力，消除毒力返强的风险。进一步缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶的asd（aspartate beta-semialdehyde）基因，构建asd平衡致死系统，用于高效表达外源基因，初步应用该载体表达了绿荧光蛋白基因（Green fluorescence protein，gfp）和致水肿大肠杆菌水肿毒素B亚基（Shiga-like toxin type Ⅱ variant B，SLT-ⅡvB），并进行了小鼠免疫试验，为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗奠定基础。主要研究内容包括： 1．crp、asd基因的克隆与重组自杀性质粒的构建 参照GenBank中鼠伤寒沙门氏菌LT2株crp及asd序列，以C500基因组为模板扩增并克隆crp与asd基因。测序及序列比对分析证实，两基因与已发表的其它3株沙门氏菌crp、asd基因全序列高度同源。从C500基因组中扩增crp及asd上下游片断，连接到自杀性质粒pRE112上，分别构建了缺失320bp的crp基因缺失320bp，插入gfp的crp缺失，以及缺失1408bp的asd基因缺失1408bp，并携带蔗糖敏感基因（sacB）的重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp和pREasd。 2．接合转移与C500crp-、C500crp-／gfp+、C500crp-／asd-、C500crp-／gfp+／asd-、C500asd-缺失株的筛选鉴定
二、融合表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和卵清白蛋白CD8~+T细胞表位的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、融合表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和卵清白蛋白CD8~+T细胞表位的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定（论文提纲范文）
（1）利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 狂犬病毒和狂犬病 |
| 1.1 病毒结构 |
| 1.2 病原学特点 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 发病机理 |
| 1.5 狂犬病毒的生活史 |
| 1.6 宿主细胞对狂犬病毒感染的应答 |
| 1.7 结语 |
| 第2章 狂犬病疫苗的研究进展 |
| 2.1 疫苗生产使用毒株简介 |
| 2.2 人用疫苗发展概况 |
| 2.3 兽用疫苗发展概况 |
| 2.4 新型狂犬病实验室疫苗模型研究进展 |
| 2.5 结语 |
| 第3章 沙门氏菌活载体疫苗研究进展 |
| 3.1 基于沙门氏菌的疫苗诱发保护性免疫应答的方法 |
| 3.2 沙门氏菌作为异源抗原的运载体研究进展 |
| 3.3 沙门氏菌作为DNA 疫苗运载体研究进展 |
| 3.4 沙门氏菌作为高级免疫调节单元研究进展 |
| 3.5 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 狂犬CTN 株抗原基因的克隆及真核表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第2章 重组沙门氏菌的构建及免疫组合方式的筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第3章 GP 线性表位肽段表面展示载体的构建及效果评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 异源PRIME-BOOST 免疫策略的评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其它成果 |
| 致谢 |
（2）表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建及动物免疫试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒Ⅱ型的研究概况 |
| 1.1 猪圆环病毒的病原学与流行病学特征 |
| 1.2 猪圆环病毒Ⅱ 型的分子生物学特征 |
| 1.2.1 基因序列特征 |
| 1.2.2 PCV2 的主要结构蛋白 |
| 1.3 猪Ⅱ 型圆环病毒的致病机制 |
| 1.3.1 致病机制 |
| 1.3.2 PCV2 的嗜组织特性 |
| 1.3.3 PCV2 侵袭宿主细胞引起其增殖的特性 |
| 1.3.4 免疫抑制 |
| 1.3.5 诱发因素 |
| 1.4 PCV2 综合防治措施 |
| 1.4.1 做好引种检疫 |
| 1.4.2 强化饲养管理，减少应激 |
| 1.4.3 定期消毒 |
| 1.4.4 免疫预防 |
| 1.4.5 药物预防 |
| 1.5 PMWS 的诊断 |
| 1.5.1 临床诊断 |
| 1.5.2 PCV2 感染的病理学诊断 |
| 1.5.3 病原学诊断 |
| 1.6 疫苗的研究进展 |
| 1.6.l 灭活疫苗 |
| 1.6.2 弱毒活疫苗 |
| 1.6.3 基因工程疫苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 表达PCV2 CAP 蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒（菌）株、质粒 |
| 2.1.2 工具酶及主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCR 引物合成 |
| 2.2.2 PCV2 ORF2 基因的扩增 |
| 2.2.3 PCR 产物电泳检测及回收 |
| 2.2.4 克隆载体的构建 |
| 2.2.5 重组表达质粒 pYA3341-ORF2 的构建 |
| 2.2.6 pYA3341-ORF2 重组质粒依次转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730 和X4550 |
| 2.2.7 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）表达蛋白的鉴定 |
| 2.2.8 重组菌苗X4550(pYA3341-ORF2)体外特性检测 |
| 2.3 结果及分析 |
| 2.3.1 PCR 扩增目的基因 |
| 2.3.2 重组克隆质粒pGEM-T-ORF2 的构建和鉴定 |
| 2.3.3 重组表达质粒pYA3341-ORF2 的构建和鉴定 |
| 2.3.4 Cap 蛋白的表达及Western blot 分析 |
| 2.3.5 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）的体外稳定性 |
| 2.3.6 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）生长状况分析 |
| 2.3.7 重组菌苗的安全性试验 |
| 2.3.8 重组菌苗口服免疫后在小鼠体内的分布和表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 目的基因的选择 |
| 2.4.2 选择减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体制备口服疫苗的原因 |
| 2.4.3 沙门氏菌的免疫机制 |
| 2.4.4 表达系统的选择—非抗性的载体-宿主平衡致死系统 |
| 2.4.5 重组疫苗株的稳定性和安全性 |
| 2.4.6 目的蛋白的表达 |
| 2.4.7 关于重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗菌株的转化及鉴定 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组菌苗X4550（PYA3341-ORF2）的动物免疫试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 试验器材 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 菌种和质粒 |
| 3.1.5 溶液的配制 |
| 3.2 小鼠免疫试验 |
| 3.2.1 重组菌X4550（pYA3341-ORF2）和X4550（pYA3341）的大量制备 |
| 3.2.2 试验小鼠分组 |
| 3.2.3 试验小鼠免疫 |
| 3.2.4 免疫小鼠血清的收集 |
| 3.2.5 免疫小鼠血清抗体效价测定 |
| 3.2.6 免疫小鼠抗体中和活性测定 |
| 3.2.7 MTT 检测重组菌苗免疫小鼠脾的T 淋巴细胞增殖 |
| 3.2.8 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定 |
| 3.3 猪免疫试验 |
| 3.3.1 重组菌X4550（pYA3341-ORF2）和X4550（pYA3341）的大量制备 |
| 3.3.2 试验猪分组 |
| 3.3.3 试验猪免疫 |
| 3.3.4 免疫猪血清的收集 |
| 3.3.5 免疫猪血清抗体的检测 |
| 3.4.6 免疫猪血清抗体中和活性检测 |
| 3.3.7 免疫猪外周血淋巴细胞增殖试验 |
| 3.4 结果及分析 |
| 3.4.1 免疫小鼠血清抗体效价检测结果 |
| 3.4.2 免疫小鼠血清抗体中和活性检测结果 |
| 3.4.3 免疫小鼠淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.4.4 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定结果 |
| 3.4.5 免疫猪血清抗体的检测 |
| 3.4.6 免疫猪血清抗体中和活性检测结果 |
| 3.4.7 免疫猪淋巴细胞转化试验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词及中英文对照 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的抗原递呈系统在肿瘤治疗性口服DNA疫苗及蛋白质疫苗制备中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的口服DNA疫苗抗原递呈系统对小鼠黑色素肿瘤的预防和治疗作用 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 沙门氏菌Ⅲ型分泌系统介导的Hsp70-TAA口服抗原转运平台在肿瘤治疗性疫苗制备中的应用 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 减毒沙门氏菌作为基因疫苗及基因治疗载体的应用 |
| 参考文献 |
| 发表论文清单 |
| 致谢 |
（4）减毒鸡伤寒沙门氏菌△asd缺失株的构建及其携带外源基因的表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 文献综述减毒沙门氏菌载体的研究进展 |
| 第一章 减毒鸡伤寒沙门氏菌97A △asd 缺失株的构建与鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 新城疫病毒F 基因部分片段在减毒鸡伤寒沙门氏菌97A △asd 缺失株中的表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 致谢 |
（5）表达Tsol18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建及其免疫学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究的目的意义 |
| 1.2 国内外的研究现状 |
| 1.3 研究内容和方法 |
| 1.3.1 Tsol18 基因的克隆和优化表达 |
| 1.3.2 重组活载体口服疫苗的构建 |
| 1.3.3 重组活载体疫苗的免疫学研究 |
| 第二章 Tsol18 基因的克隆、优化表达及高免血清的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种和试剂 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪带绦虫虫卵的活化 |
| 2.2.2 六钩蚴总RNA 的提取 |
| 2.2.3 Tsol18 基因的RT-PCR 扩增 |
| 2.2.4 pGEX-4T-Tsol18 表达载体的构建 |
| 2.2.5 重组质粒的诱导表达 |
| 2.2.6 表达产物的检测 |
| 2.2.7 表达产物的表达形式分析 |
| 2.2.8 表达蛋白纯化和稳定性分析 |
| 2.2.9 重组蛋白Tsol18 高免血清的制备 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Tsol18 的RT-PCR 扩增 |
| 2.3.2 表达载体的鉴定与序列分析 |
| 2.3.3 表达产物的检测 |
| 2.3.4 表达蛋白纯化和稳定性分析 |
| 2.3.5 免疫兔血清的效价 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 选择Tsol18 作为免疫保护基因的原因 |
| 2.4.2 Tsol18 的表达形式和稳定性 |
| 第三章 表达 Tsol18 抗原的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 疫苗菌的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂和耗材 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 TsoL18 目的基因的制备 |
| 3.2.2 pYA3341-Tsol18 重组质粒的构建和筛选 |
| 3.2.3 pYA3341-Tsol18 重组质粒依次转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730 和X4550 |
| 3.2.4 4550（pYA3341-Tsol18）重组菌表达蛋白的测定 |
| 3.2.5 重组菌的体外稳定性试验 |
| 3.2.6 重组菌生长曲线的测定 |
| 3.2.7 重组菌的安全性试验 |
| 3.2.8 重组疫苗株口服免疫后在小鼠体内的分布 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Tsol18 目的基因的制备 |
| 3.3.2 pYA3341-Tsol18 重组质粒的鉴定 |
| 3.3.3 Tsol18 重组蛋白的表达及Westren blot 分析 |
| 3.3.3 Tsol18 重组蛋白的Westren blot 分析 |
| 3.3.4 重组菌X4550（pYA3341-Tsol18）的体外稳定性 |
| 3.3.5 重组菌生长曲线的测定 |
| 3.3.6 重组菌的安全性实验 |
| 3.3.7 重组疫苗株口服免疫后在小鼠体内的分布 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 重组疫苗菌 X4550(pYA3341-Tsol18)的免疫学研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种和质粒 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂和耗材 |
| 4.1.4 培养液 |
| 4.1.5 溶液的配制 |
| 4.1.6 重组菌X4550（pYA3341-Tsol18）和X4550（pYA3341）的大量制备 |
| 4.2 小鼠免疫实验 |
| 4.2.1 实验小鼠分组 |
| 4.2.2 实验小鼠免疫 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清的收集 |
| 4.2.4 免疫小鼠肠道分泌性抗Tsol18 IgA 抗体的测定 |
| 4.2.5 免疫小鼠抗Tsol18 抗体的检测 |
| 4.2.6 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定 |
| 4.3 猪免疫实验 |
| 4.3.1 重组菌X4550（pYA3341-Tsol18）和X4550（pYA3341）的大量制备 |
| 4.3.2 实验动物的分组与口服接种 |
| 4.3.3 实验猪血清抗体的检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ELISA 最佳条件的选择 |
| 4.4.2 免疫小鼠血清抗Tsol18 抗体的检测 |
| 4.4.3 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定 |
| 4.4.4 实验猪血清抗体的检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 寄生虫免疫逃避机制 |
| 4.5.2 粘膜免疫 |
| 4.5.3 粘膜免疫的优点 |
| 4.5.4 小鼠免疫实验分析 |
| 4.5.5 猪免疫实验分析 |
| 第五章 全文结论 |
| 第六章 文献综述减毒沙门氏菌作为口服疫苗活载体的研究进展 |
| 6.1 沙门氏菌减毒的相关基因 |
| 6.1.1 控制芳香族化合物生物合成的aro 基因 |
| 6.1.2 影响碳水化合物利用途径的galE 基因 |
| 6.1.3 pur 系列基因 |
| 6.1.4 asd 基因 |
| 6.1.5 htrA 基因 |
| 6.1.6 cya、crp 基因 |
| 6.2 减毒沙门氏菌载体激发的免疫应答 |
| 6.3 载体减毒沙门氏菌表达系统的构建 |
| 6.3.1 质粒表达系统 |
| 6.3.2 染色体整合系统 |
| 6.3.3 载体-宿主平衡致死系统 |
| 6.4 沙门氏菌进入机体免疫系统的机制 |
| 6.4.1 沙门氏菌通过粘膜上皮M 细胞进入机体 |
| 6.4.2 沙门氏菌被树突细胞直接从肠腔摄取进入机体 |
| 6.5 减毒沙门氏菌的应用 |
| 6.5.1 常用的减毒沙门氏菌菌株 |
| 6.5.2 携带DNA 疫苗的重组减毒沙门氏菌的应用 |
| 6.5.3 表达外源抗原的重组减毒沙门氏菌疫苗的应用 |
| 6.6 减毒沙门氏菌载体疫苗的优越性 |
| 6.6.1 抗原呈递的有效性 |
| 6.6.2 细菌载体的佐剂作用 |
| 6.6.3 细菌CpG 序列 |
| 6.6.4 激发粘膜免疫 |
| 6.6.5 减毒沙门氏菌运载效应易于强化 |
| 6.6.6 免疫具有持续性 |
| 6.6.7 抗原不需提纯 |
| 6.6.8 应用方便 |
| 6.7 潜在的危险性 |
| 6.7.1 弱毒细菌的危险性 |
| 6.7.2 质粒DNA 的危险性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）大肠杆菌K88ac-ST Ⅱ融合基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达与免疫（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献综述一 产肠毒素大肠杆菌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究现状 |
| 参考文献 |
| 实验一 重组减毒沙门氏菌 X4550（pYA3334-K88ac-STII）的构建与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 重组菌 X4550(pYA3334-K88ac-STII)的免疫效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件一 |
| 附件二 |
| 附件三 |
| 附件四 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（7）重组减毒细菌运送CD8+T细胞表位的效应分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组菌的准备 |
| 1.2.2 F1小鼠骨髓源树突状细胞 (BMDC) 的制备 |
| 1.2.3 重组菌感染抗原提呈细胞的试验 |
| 1.2.4 抗原提呈细胞对T细胞表位的提呈试验 |
| 1.2.5 LKb细胞、 LLd细胞对T细胞表位提呈的动力学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组菌感染后GFP+ |
| 2.2 重组菌感染后GFP+ |
| 2.3 非专职APC对重组菌表达的T细胞表位的提呈 |
| 2.4 专职APC对重组菌表达的T细胞表位的提呈 |
| 2.5 非专职APC对重组菌表达的T细胞表位提呈的动力学 |
| 3 讨论 |
（8）减毒沙门氏菌介导的冠状病毒基因疫苗及其免疫生物学特性（论文提纲范文）
| 摘 要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 冠状病毒的分子生物学和免疫学研究进展 |
| 0.1 冠状病毒分类 |
| 0.2 冠状病毒的形态与结构 |
| 0.3 冠状病毒的复制 |
| 0.4 冠状病毒的进化 |
| 0.5 冠状病毒的基因在致病机理中的作用 |
| 0.6 感染免疫 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡传染性支气管炎病毒和小鼠肝炎病毒51 基因和 N 基因的克隆和序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 运送 IBV、MHV 51 基因、N 基因真核表达质粒的减毒沙门氏菌的构建及其在小鼠体内诱导的免疫应答 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 运送共表达鸡IFN-γ、IL-18 和嵌合 CpG DNA 的 IBV DNA 疫苗的减毒沙门氏菌的构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 减毒沙门氏菌介导的 IBV DNA 疫苗的免疫效力 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间发表的学术论文 |
（9）产单核细胞李斯特菌减毒突变株的构建及其免疫生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 中 文 摘 要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照 |
| 文献综述 |
| 1 李斯特菌病的流行病学特征 |
| 2 LM 的分子致病机理 |
| 3 抗李斯特菌免疫应答机理 |
| 4 具有潜在应用价值的 LM 疫苗 |
| 参考文献 |
| 第一章 产单核细胞李斯特菌actA 基因和hly 基因的原核表达及 ActA 单克隆抗体的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章产单核细胞李斯特菌减毒突变株的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 LM 减毒突变株的免疫生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 表达 GFP 的 LM 减毒突变株的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 减毒沙门氏菌疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 经典的沙门氏菌疫苗 |
| 1.1.2 新型沙门氏菌减毒疫苗 |
| 1.1.3 想的减毒疫苗 |
| 1.2 减毒沙门氏菌载体的研究进展 |
| 1.2.1 减毒沙门氏菌载体的优点 |
| 1.2.2 减毒沙门氏菌载体的缺点与解决方法 |
| 1.2.3 选择标记的使用 |
| 1.2.4 DNA疫苗载体 |
| 1.2.5 减毒沙门氏菌载体在国内的应用 |
| 1.3 猪霍乱沙门氏菌的危害与防制 |
| 1.3.1 病原学 |
| 1.3.2 流行病学 |
| 1.3.3 发病机制 |
| 1.3.4 临床症状 |
| 1.3.5 病理变化 |
| 1.3.6 诊断 |
| 1.3.7 预防措施 |
| 1.3.8 治疗 |
| 1.4 猪霍乱沙门氏菌疫苗及载体的研究进展 |
| 1.4.1 国外研究进展 |
| 1.4.2 国内研究进展 |
| 第2章 研究目的与意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株和培养条件 |
| 3.1.2 工具酶和试剂 |
| 3.1.3 主要培养基及其配制 |
| 3.1.4 缓冲液 |
| 3.1.5 细菌基因组DNA提取试剂 |
| 3.1.6 实验动物 |
| 3.1.7 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 沙门氏菌基因组DNA提取 |
| 3.2.2 PCR或酶切产物的回收与纯化 |
| 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.4 连接产物的转化 |
| 3.2.5 重组质粒的快速鉴定 |
| 3.2.6 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.7 质粒的制备 |
| 3.2.8 沙门氏菌电转化 |
| 3.2.9 沙门氏菌ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.10 大肠杆菌原核表达 |
| 3.2.11 沙门氏菌属的PCR鉴定 |
| 3.2.12 猪霍乱沙门氏菌C500株crp及asd基因的克隆与鉴定 |
| 3.2.13 重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp、pREasd的构建 |
| 3.2.14 接合转移与C500crp~-、C500crp~-/gfp~+、C500crp~-/asd、C500crp~-/gfp~+/asd、C500asd缺失株的筛选鉴定 |
| 3.2.15 C500crp~-缺失株生物学特性鉴定 |
| 3.2.16 C500crp~-缺失株对小鼠的免疫试验 |
| 3.2.17 C500crp~-缺失株对小鼠的攻毒保护试验 |
| 3.2.18 绿荧光蛋白基因gfp在沙门氏菌中的表达 |
| 3.2.19 致水肿病大肠杆菌水肿毒素B亚基(SLT-Ⅱ vB)在C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 crp、asd基因的克隆与序列分析 |
| 4.1.1 crp基因的克隆与序列分析 |
| 4.1.2 asd基因的克隆与序列分析 |
| 4.2 重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp、pREasd的构建 |
| 4.2.1 重组自杀性质粒pREcrp的构建 |
| 4.2.2 重组自杀性质粒pREcrpgfp的构建 |
| 4.2.3 重组自杀性质粒pREasd的构建 |
| 4.3 C500crp~-、C500crp~-/gfp~+、C500crp~-/asar、C500crp~-/gfp~+/asar、C500asd缺失株的筛选与鉴定 |
| 4.3.1 C500crp~-缺失株的筛选与鉴定 |
| 4.3.2 C500crp~-/gfp~+缺失株的筛选与鉴定 |
| 4.3.3 C500crp~-/asd、C500crp~-/gfp~+/asd、C500asd缺失株的筛选与鉴定 |
| 4.4 C500crp~-缺失株生物学特性鉴定 |
| 4.4.1 C500crp~-缺失株表型鉴定 |
| 4.4.2 C500crp~-缺失株生长特征鉴定 |
| 4.4.3 C500crp~-缺失株对小鼠的毒力试验 |
| 4.5 C500crp~-缺失株对小鼠的免疫试验 |
| 4.6 C500crp~-缺失株对小鼠的保护试验 |
| 4.7 gfp在C500及C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
| 4.7.1 gfp的克隆 |
| 4.7.2 gfp在C500及C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
| 4.8 SLT-Ⅱ vB在C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
| 4.8.1 SLT-Ⅱ vB的克隆 |
| 4.8.2 SLT-Ⅱ vB在C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
| 4.8.3 重组菌C500crp~-/asd (pYASLTⅡB)对小鼠的免疫试验 |
| 4.8.4 重组菌C500crp~-/asd (pYASLTⅡB)诱导小鼠的DTH反应 |
| 4.8.5 重组菌C500crp~-/asd (pYASLⅡIB)诱导小鼠的免疫保护反应 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 crp缺失对毒力及免疫原性的影响 |
| 5.2 重组自杀性质粒介导基因整合的筛选鉴定 |
| 5.3 外源基因在C500crp~-/gfp~+缺失株染色体中的表达效率 |
| 5.4 gfp基因在C500crp~-/asd缺失株平衡致死系统中的表达 |
| 5.5 SLT-Ⅱ vB基因在C500crp~-/asd缺失株平衡致死系统中的表达 |
| 5.6 重组菌C500crp~-/asd (pYASLTⅡB)对小鼠的免疫试验 |
| 5.7 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、融合表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和卵清白蛋白CD8~+T细胞表位的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定（论文参考文献）
- [1]利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究[D]. 郭恒. 吉林大学, 2011(05)
- [2]表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建及动物免疫试验[D]. 赵红妮. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [3]减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的抗原递呈系统在肿瘤治疗性口服DNA疫苗及蛋白质疫苗制备中的应用[D]. 朱向莹. 复旦大学, 2010(11)
- [4]减毒鸡伤寒沙门氏菌△asd缺失株的构建及其携带外源基因的表达[D]. 陈晓娟. 扬州大学, 2009(01)
- [5]表达Tsol18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建及其免疫学研究[D]. 丁军涛. 中国农业科学院, 2008(10)
- [6]大肠杆菌K88ac-ST Ⅱ融合基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达与免疫[D]. 杨冬梅. 石河子大学, 2007(01)
- [7]重组减毒细菌运送CD8+T细胞表位的效应分析[J]. 潘志明,张晓明,焦新安,Richard Lo-Man,Claude Leclerc,刘秀梵. 细胞与分子免疫学杂志, 2006(06)
- [8]减毒沙门氏菌介导的冠状病毒基因疫苗及其免疫生物学特性[D]. 焦红梅. 扬州大学, 2006(03)
- [9]产单核细胞李斯特菌减毒突变株的构建及其免疫生物学特性的研究[D]. 殷月兰. 扬州大学, 2006(03)
- [10]猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用[D]. 徐引弟. 华中农业大学, 2006(02)