(珠海市妇幼保健院广东珠海519000）
【摘要】目的：评价基于实时荧光PCR的探针熔解曲线分析（PMCA）技术作为耳聋基因基因诊断的可行性。方法：选取2017年1－4月在珠海市妇幼保健院出生的经MALDI-TOF-MS诊断为耳聋基因携带者的婴儿的脐带血标本92份和正常的脐带血标本4份，采用PMCA技术对上述96份标本进行耳聋基因检测，检测结果不一致的样本，以DNA测序技术作为金标准，对上述两种方法检测耳聋基因突变的检测性能进行评估。结果：探针熔解曲线分析法除了2例不在检测范围外，其余的94份标本均能正确检出。经测序鉴定，该两例未能检测出，是由于基因检测位点的不同所导致。结论：PMCA技术可作为MALDI-TOF-MS技术检测耳聋基因基因突变的替代或验证方法。
【关键词】耳聋基因诊断；熔解曲线分析；质谱分析
【中图分类号】R764.43【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2019）27-0028-03
Comparisonbetweentheprobemeltingcurveanalysisbasedonreal-timefluorescencePCRandMassSpectrometryforgenediagnosisofdeafness
WangGe
ZhuhaiMunicipalMaternityandChildHealthcareHospital,Zhuhai,Guangdong519000,China
【Abstract】ObjectiveToevaluatethereliabilityoftheprobemeltingcurveanalysis(PMCA)basedonreal-timefluorescencePCRforgenediagnosisofdeafness.MethodsFromJanuarytoApril2017,92umbilicalcordbloodsamplesand4normalumbilicalcordbloodsamplesfrominfantsdiagnosedasdeafgenecarriersbyMALDI-TOF-MSwerecollectedfromZhuhaiMaternalandChildHealthcareHospital.ThePMCAtechniquewasusedtodetectthedeafnessgenein96samples.TheDNAsequencingtechniquewasusedasthegoldstandardtoevaluatethedetectionperformanceoftheabovetwoMethodsfordetectingthegenemutationofdeafness.ResultsThegenotypesof96CasesweredetectedaceuralelybasedonthePMCAassayexceptfortwocases:Twocaseswerenotinthedetectionrange,Sequencingconfirmedthatthetwocasescouldnotbedetectedbecauseofthedifferencesingenedetectionsites.ConclusionPMCAtechniquecanbeusedasasubstituteorverificationmethodfordetectinggenemutationofdeafnessbyMALDI-TOF-MS.
【Keywords】Genemutationdiagnosisofdeafness;Probemeltingcurveanalysis;MasssPectrometryanalysis.
先天性耳聋是由多种环境和/或遗传因素共同作用导致，也可由单一基因或不同基因的复合突变所导致，在新生儿期的发病率约为１‰～1.86‰[1]。目前针对基因检测的方法主要有质谱分析技术（MALDI-TOF-MS）[6]、基因测序技术[2]、反向点杂交技术和熔解曲线技术。实时荧光检测技术的探针熔解曲线分析法(Probemeltingcurveanalysis，PMCA)，临床应用日趋广泛，能够在一次扩增之后通过检测PCR产物多色荧光熔解曲线就可鉴定多种突变。本研究以DNA测序技术为金标准，比较PMCA和质谱技术检测突变耳聋基因的性能，评价其作为常规检测耳聋基因技术的可行性。
1.资料与方法
1.1一般资料
收集2017年1月－4月在珠海市妇幼保健院出生，经MALDI-TOF-MS技术诊断为耳聋基因携带者的婴儿脐带血标本92份和正常标本4份，本研究得到珠海市妇幼保健院伦理委员会批准，受检者均签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1标本处理上述脐带血标本均采用乙二胺四乙酸三钾(EDTA—K2)抗凝，采用致善快速DNA提取仪抽提人类白细胞基因组DNA，采用紫外分光仪于260、280nm处测定吸光度(A)值，以鉴定所抽提DNA的质量并计算其浓度，保证所抽提的DNA符合质量要求，使用时稀释至20ng/ul。
1.2.2耳聋基因的检测PCR的探针熔解曲线分析试剂盒由厦门致善生物技术有限公司生产。检测位点包括中国人群常见4个耳聋基因的20种基因突变，分别为GJB2：c.35delG，c.167delT，c.176-191del16bP，c.235delC，c.299-300delAT；GJB3：c.538C＞T，c.547G＞A；mtDNA：m.1494C＞T，m.1555A＞G；SLC26A4：c.749T＞C；c.754T＞C，c.919-2A＞G，c.1174A＞T，c.1226G＞A，c.1229C＞T，c.1707+5G＞A，c.1975G＞C，c.2017T＞A，c.2162C＞T，c.2168A＞G。20种突变分为A、B、C、D四管进行。检测过程如下：先将泡罩包装的耳聋检测PCR反应管A/B/C/D从试剂盒取出，瞬时离心，然后将预先稀释好的待测DNA标本25ul直接加到含PCR反应液粉末的A/B/C/D四管中，盖严管盖后于涡旋振荡器中充分振荡混匀20s，短暂离心后，转移至SLAN-96上进行PCR扩增及熔解曲线分析。然后按照试剂盒说明书对所采集的荧光数据进行结果分析。
1.2.3检测结果不一致样本的测序检测结果不一致样本外送华大基因进行测序分析。
2.结果
2.1耳聋基因检测方法的比较
96例患者经两种方法进行耳聋基因的检测，其中94例检测结果相同，分别为90例具有耳聋基因突变的患者和4例无耳聋基因突变患者。2例患者耳聋基因检测结果不同。具体见表。
2.2两种检测方法差异样本的分析
对2例检测结果不同的样本进行了测序分析，发现都具有SLC26A4：281C＞T的突变，而熔解曲线法检测的耳聋基因没有包括该位点。
3.讨论
我国新生儿听力筛查阳性率为1‰，而14岁以下儿童的耳聋患病率约为3.5‰，其中每年约有2.4万遗传性耳聋儿童不能通过新生儿听力筛查检测出来[2]。MALDI-TOF-MS作为常用的新生儿耳聋基因的筛查方法，具有高通量优点，但高昂的设备和试剂费用以及适合大批量检测，严重限制了该技术的普及，基本都是外送第三方检测公司，时效性不足。熔解曲线法具有简单快速的特点，而且对设备与场地要求相对较低，医疗机构的分子生物学实验室即可开展，具有巨大的应用潜力。
我们选取了2017年1月－4月96例样本，其中90例经MALDI-TOF-MS检测为阳性，采用熔解曲线法进行检测，结果显示突变位点相同。4例样本经MALDI-TOF-MS检测为阴性，熔解曲线法检测也为阴性。有2例样本MALDI-TOF-MS检测为阳性，熔解曲线法检测为阴性，将该样本进行测序分析，发现两例皆存在SLC26A4：281C＞T位点的杂合突变，而熔解曲线法耳聋基因检测没有包括该位点。两种检测方法只有两个耳聋基因检测位点不同，都位于SLC26A4区域，MALDI-TOF-MS为281C＞T,589G＞A,熔解曲线法为749T＞C,754T＞C，国内对新生儿281C＞T,589G＞A位点的突变进行了一定的筛查，蓝培基[3]对广东省韶关市328例新生儿进行耳聋基因检测，没有发现281和589位点的基因突变，李振安[4]对40672例佛山市新生儿进行耳聋基因筛查，发现281C＞T,589G＞A杂合突变各2例。唐燕青[5]对21386例广西新生儿进行耳聋基因筛查，发现589G＞A杂合突变2例，281C＞T杂合突变1例。在前期研究中，我们对珠海9775例新生儿进行耳聋筛查，发现了2例589G＞A杂合突变，没有存在281C＞T的突变[6]。PUDai[7]等人在205例非综合征型感音神经性听力受损而颞骨无异常患儿中检测出一例749T＞C突变,H-JParkde[8]等人在86例耳聋患儿在检测出1例754T＞C的突变。检测结果显示在新生儿耳聋基因检测方面上述两种方法具有良好的一致性。但该研究还存在着以下几个方面的不足：（1）阴性样本数量不足；（2）两种检查方法中4个耳聋基因18个相同的热点突变位点只评估了13个；（3）需进行多重突变的评估。
综上所述，熔解曲线法与MALDI-TOF-MS在检测新生儿耳聋基因方面具有良好的一致性，可以替代MALDI-TOF-MS，值得在临床推广应用，可以促进遗传性耳聋患者的早发现、早诊断、早干预，对该病的防控，提高出生人口素质具有重要的意义。
【参考文献】
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