论文摘要
目的:根据IASP最新的疼痛定义,疼痛是一种与组织损伤或潜在的组织损伤相关的令人痛苦的经历,包括痛的感觉分辨、情绪、认知和社会成分。痛厌恶情绪是慢性疼痛的重要要组成,它不仅给人带来不良的精神情感体验,而且还会加强伤害性刺激引起的感觉分辨程度,严重影响患者的身心健康和生活质量,但其机制尚不清楚。越来越多的证据表明,前扣带皮层吻侧部(r ACC)在慢性疼痛的处理过程中起着重要作用,动物行为研究表明破坏源自r ACC的神经元可以阻止急性有害刺激引起的厌恶状态和负面情绪。临床影像学检查表明,r ACC区域可能被有害刺激和疼痛引起的不愉快所激活。一些研究证实,NMDA受体在突触传递,长时程增强,学习和记忆,癫痫,疼痛等方面起重要作用;ACC脑区有大量离子型谷氨酸受体分布;还有研究发现r ACC区NMDA受体的Glu N2A和Glu N2B亚基有助于福尔马林诱导的条件位置回避(formalin induced conditioned place avoidance,F-CPA)行为的形成,这都预示ACC脑区的NMDA受体在痛厌恶情绪中起着重要作用。我们已知NMDA受体主要有Glu N1、Glu N2A和Glu N2B亚基,不同亚基在痛厌恶情绪中如何发挥作用并不清楚。本实验室在前期研究中给大鼠脚掌皮下注射CFA也成功诱导出了CPA反应(C-CPA),本研究将利用此模型,结合在体多通道电生理记录、Western blot蛋白检测和免疫荧光双标等技术对NMDA受体不同亚基在痛厌恶情绪中发挥的作用做更进一步的研究。方法:1.建立CFA诱导的慢性持续性疼痛模型。实验中,我们使用雄性Sprague-Dawley大鼠(体重250260g),在其左侧后脚掌皮下注射CFA;对照组则给予皮下注射相同剂量的生理盐水(normal saline,NS)。2.建立CFA诱导的条件性位置回避(C-CPA)模型。分为三组:(a)空白对照组;(b)脚掌注射生理盐水组;(c)脚掌注射CFA模型组,n=612只/组。盐水或CFA的注射剂量为0.08ml/只。CFA作为致痛物质注射于大鼠左后脚掌皮下,引起大鼠的慢性炎性疼痛反应,并结合可区分的环境条件适应,大鼠对受伤害侧环境产生CPA的行为反应,即造模成功。3.r ACC中注射APⅤ或DNQX对C-CPA行为反应的影响。在该实验中,将大鼠分成22组,(1)在大鼠左侧后脚掌注射CFA,在r ACC中注射NS;(2)在左侧后脚掌注射NS,在r ACC中注射NS;(3)CFA被注射于左后脚掌皮下,r ACC内分别给予0.5/2/8/16nmol/μl APⅤ或DNQX;(4)在左侧后脚掌注射NS,r ACC内分别给予0.5/2/8/16nmol/μl APⅤ或DNQX。4.检测热缩足反应潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWL)PWL将在第1天和第3天训练C-CPA行为后进行测试。5.采用在体多通道电生理记录技术,处理和分析r ACC神经元放电活动的变化。6.通过Western-blot检测NMDA受体Glu N1、Glu N2A和Glu N2B的磷酸化水平。完成行为测试后,我们通过Western-blot检测各组r ACC区NMDA受体Glu N1、Glu N2A和Glu N2B亚基的磷酸化水平。7.免疫荧光双标染色。结果:1.行为学结果1.1.大鼠左侧后脚掌皮下注射CFA后,热缩足反应潜伏期(PWL)显著降低。大鼠左侧后脚掌皮下注射CFA,r ACC脑区内注射NS,建立慢痛模型,空白对照组左侧后脚掌皮下注射NS,测量第一天与第三天热缩足反应的时间,发现注射CFA之后,第三天热缩足反应潜伏期明显缩短(P<0.05),其余两组无明显变化。说明左侧后脚掌注射CFA后,大鼠的PWL显著降低。1.2.在自由活动测试中,脚掌注射CFA大鼠在疼痛环境中停留的时间明显减少。在空白对照组和NS组中,大鼠Day 3与Day 1在“疼痛环境”中的停留时间相比差异无统计学。两组的回避分数相比,也无统计学差异。左侧后脚掌注射CFA(P<0.05),大鼠在Day 3在“疼痛环境”匹配室停留时间明显少于Day1,与未注射对照组及注射NS对照组的回避分数相比,有统计学差异(P<0.05),说明大鼠对“疼痛环境”产生明显的逃避反应,停留的时间显著减少。1.3.r ACC内注射APⅤ可以抑制大鼠C-CPA反应,但DNQX不能产生类似的影响。在大鼠左侧后脚掌皮下注射CFA,并且r ACC内给予NS的处理组中,Day3在“疼痛环境”停留的时间明显少于Day 1,回避分数增大,对“疼痛环境”产生明显的回避。大鼠后脚掌注射CFA,r ACC分别注射不同剂量(0.5/2/8/16 nmol/μl)APⅤ,其中,在APⅤ注射剂量为(2/8/16 nmol/μl)组中,回避分数逐渐减小,三组间差异无统计学意义,但与注射NS组相比,均有统计学差异(P<0.05),说明一定浓度的APⅤ可以抑制C-CPA反应。大鼠后足脚掌注射CFA,且在r ACC分别注射不同剂量的(0.5/2/8/16 nmol/μl)DNQX,各组回避分数没有变化,与注射NS组相比,没有统计学差异,说明APⅤ可以抑制大鼠C-CPA反应,但DNQX则无类似的作用,提示C-CPA反应是由NMDA受体介导的,与AMPA受体无关。1.4.大鼠r ACC内注射APⅤ和DNQX不改变热缩足反应潜伏期(PWL)。大鼠后脚掌注射CFA,r ACC注射APⅤ或DNQX,各组大鼠的PWL明显缩短(P<0.05)。说明APⅤ和DNQX没有改变大鼠的PWL。2.电生理结果第一天检测大鼠的基础放电频率,第二天大鼠左侧后脚掌注射CFA,r ACC内分别注射不同浓度(0.5/2/8/16 nmol/μl)的NMDA受体拮抗剂APⅤ,第三天观察注射不同浓度APⅤ的大鼠r ACC脑区放电频率。CFA+NS组:在“非痛环境”中的动作电位频率与在“痛环境”的动作电位频率相比,差异有统计学意义(P<0.05);CFA+2/8/16 nmol/μl APⅤ组:在“非痛环境”的动作电位频率与在“痛环境”的动作电位频率相比,差异无统计学意义。说明APⅤ下调了由CFA引起的神经元活动的放电频率,其中特意将其痛侧部分加以比较,发现高剂量的APⅤ明显抑制了由CFA诱导的神经元放电活动的增强,差异有统计学意义(P<0.05)。CFA+0.5/2/8/16 nmol/μl DNQX组:在“痛环境”的放电频率比在“非痛环境”的放电频率高,差异有统计学意义(P<0.05),说明r ACC内注射DNQX并不能影响由CFA引起的神经元放电活动频率的增高。3.蛋白检测结果比较大鼠左侧后脚掌注射CFA,r A CC内注射NS组和大鼠左侧后脚掌注射CFA,r ACC内给予不同浓度0.5/2/8/16 nmol/μl APⅤ组,其中与CFA+NS组相比,CFA+0.5 nmol/μl APⅤ组各亚基磷酸化水平没有显著差异,无统计学意义;而CFA+2/8/16 nmol/μl APⅤ组各亚基磷酸化水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05,n=5)。结论:通过使用APⅤ拮抗NMDA受体可以抑制由CFA引起的疼痛反应,降低由CFA诱导的r ACC神经元放电频率的增高,下调r ACC内Glu N1、Glu N2A和Glu N2B亚基的磷酸化水平。APⅤ浓度为2/8/16 nmol/μl时,可以抑制由CFA引起的疼痛反应,较小剂量则不能引起改变,DNQX也没有引起任何变化。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 关晓雅
导师: 张宇
关键词: 完全弗氏佐剂,条件位置回避,前扣带皮层吻侧,受体,电活动
来源: 山西医科大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 山西医科大学
基金: 国家自然科学基金“电针影响前扣带皮层神经元活动缓解痛情绪的作用及机制研究(编号:81371254)”
分类号: R338
总页数: 59
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