郭苏文(包头医学院第一附属医院保健中心014000)
【中图分类号】R735.2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）46-0235-02
【摘要】目的探讨氯化钴对人胃癌细胞SGC7901的体外抑制作用及其可能机制。方法将培养的人胃癌细胞SGC7901给予不同浓度氯化钴处理，以噻唑蓝(MTT)比色法检测人胃癌细胞SGC7901增殖及增殖抑制情况。用Western-blot方法检测氯化钴对人胃癌SGC7901细胞p-ERK1/2蛋白表达水平的影响。结果浓度低于50.0μmolL-1对细胞增殖无影响（p＞0.05，VScontrol）；而浓度高于100μmolL-1氯化钴抑制其增殖（p<0.01，VScontrol）；高于100μmolL-1氯化钴引起p-ERK1/2蛋白表达水平降低。结论一定浓度氯化钴对人胃癌细胞SGC7901增殖有明显抑制作用，氯化钴的抗肿瘤机制可能与p-ERK1/2蛋白表达水平降低有关。
【关键词】氯化钴人胃癌细胞SGC7901抑制p-ERK1/2
钴是正常人体所必须的微量元素，它是维生素B12极其重要的组成成分。钴被广泛用于诱导细胞化学缺氧损伤，常用化合物是氯化钴[1-2]。有研究表明，氯化钴处理Hela和A549细胞24小时，可引起这两种细胞不同程度的凋亡[3]。化疗是治疗肿瘤的常用手段，本研究在体外实验中观察氯化钴对人胃癌细胞SGC7901的作用，研究氯化钴是否对人胃癌细胞SGC7901的增殖具有抑制作用，为氯化钴进一步发展成一种新型的抗肿瘤药物提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1细胞株
人胃癌细胞SGC7901，购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。在37℃、饱和湿度及5％CO2条件下，用培养瓶在含10％胎牛血清、1×105u•L-1青链霉素的RPMI1640培养液中传代培养。
1.1.2主要试剂
RPMI1640培养基（Gibico公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），胰蛋白酶（上海华美生物工程公司），台盼兰（上海华美生物工程公司）。二甲基亚砜（Amersco），MTT（Amersco），十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺等化学试剂购自Sigma公司。BCA蛋白分析试剂盒购自PIERCE公司。抗actin兔多克隆抗体、抗p-ERK1/2兔多克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔IgG均购自SantaCruze公司。ECL反应试剂盒购自PIERCE公司。其他试剂为分析纯。
1.1.3主要仪器
二氧化碳培养箱（ThermoformaofTHEU.S.A），倒置相差显微镜（XDB-1B，国产），超净工作台（SW-CJ-2F，上海博迅），自动双重纯水蒸馏器（SZ-98，上海本波仪器有限公司），手提式压力蒸汽消毒器（YXQ02型，山东），电热恒温鼓风干燥箱（Gzx-dh.500-bs，上海），电子天平（FA1004，上海恒平科学仪器公司），全自动酶标仪（ELX-800ofTHEU.S.A）。
1.2方法
1.2.1细胞培养：人胃癌细胞SGC7901在37℃、饱和湿度及5％CO2条件下，用培养瓶在含10％胎牛血清，1×105u•L-1青链霉素的RPMI1640培养液中传代培养。
1.2.2细胞增殖试验：采用噻唑蓝（MTT）比色法测定人胃癌细胞SGC7901的增殖情况。将单层人胃癌细胞SGC7901消化，倾去消化液后用含10%胎牛血清的RPMI1640配制成5×104个细胞/mL的悬液，在96孔细胞培养板中每孔接种0.2mL。在5%CO2、饱和湿度条件下、37℃培养24h后吸弃培养液，分别加入含终浓度为10.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0μmolL-1氯化钴的RPMI1640培养液，各浓度组均重复6孔。在上述培养条件下分别培养24小时后，加入MTT试剂，测定490nm的吸光率(MTT测定值)。实验中同时设置不含氯化钴的对照组，其重复孔数、温度和湿度条件、时间等均与试验组相同。
1.2.3免疫蛋白印迹实验（WesternBlot）将人胃癌细胞SGC7901悬液接种于六孔培养皿中,培养至贴壁面积达80%-90%时弃去培养液，换上无血清培养基培养12小时,按实验分组分别加入不同浓度的氯化钴，分别为10μmol•L-1、50.0μmol•L-1、100.0μmol•L-1、200.0μmol•L-1、400.0μmol•L-1、800.0μmol•L-1，对照组不加药物。作用24h后，用RIPA+PMSF细胞裂解液在冰上裂解细胞，低温离心15分钟提取蛋白，BCA法蛋白定量。加上样缓冲液，100℃变性5分钟。每孔50μg蛋白上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白电转到硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉封闭1小时，加一抗稀释液(1：1000稀释)4℃过夜，TTBS洗膜，结合辣根过氧化物酶标记二抗(1：5000稀释)，TTBS洗膜，用ECL化学发光试剂在X光胶片上暴光、显影、定影。以actin为内参照，应用凝胶成像分析系统进行条带扫描分析结果，结果以蛋白条带的面积积分值与actin的面积积分值比值表示。实验重复3次。
1.2.4统计学处理
采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析，统计数据以均数±标准差（-x±s）表示，P<0.05为差别有统计学意义。
2结果
2.1氯化钴对人胃癌SGC7901细胞生长的抑制作用
低于50.0μmolL-1氯化钴浓度组对人胃癌细胞SGC7901增殖无影响（p＞0.05，VScontrol）；而高于100μmolL-1浓度组抑制其增殖（p<0.01，VScontrol）(见表1)。
表1人胃癌细胞SGC7901在不同浓度的氯化钴作用24小时后测定的MTT值（x±s）n=6
3讨论
氯化钴为红色单斜晶体，被广泛用于诱导细胞化学缺氧损伤[4]。氯化钴的细胞损伤效应可能与所诱发的活性氧族、丝裂原激活的蛋白激酶的磷酸化和P53产生有关[5]。本实验观察到氯化钴在低浓度范围内表现出轻微的细胞毒性，随着其浓度的增加，体外培养的人胃癌细胞SGC7901的存活率明显下降，提示一定浓度氯化钴有抑制肿瘤细胞生长的作用。
ERK1/2信号转导通路是近年来研究的热点，它是介导细胞外刺激到细胞内反应的重要信号转导系统，在细胞增殖过程中起重要调节作用[6]。研究表明，作为重要的细胞周期相关蛋白激酶途径，ERK1/2信号途径受到抑制是多种细胞凋亡的一个重要原因，这主要是因为ERK1/2激酶与Bcl-2家族蛋白有着密切的关系，ERK1/2的激活不但可以上调Bcl-2等抗凋亡蛋白的表达，而且可以诱导其活化[7，8]。实验观察了氯化钴对人胃癌细胞SGC7901p-ERK1/2表达的影响。研究发现在一定的作用时间范围内，低浓度氯化钴组对p-ERK1/2蛋白表达无影响，而高浓度氯化钴可下调人胃癌细胞SGC7901中p-ERK1/2蛋白的表达，这一变化趋势与MTT的结果基本一致。提示氯化钴可能通过抑制p-ERK1/2蛋白的表达进而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用，这一结果为氯化钴防治胃癌的临床应用奠定理论基础。由于细胞凋亡是一个极其复杂、涉及多步骤、多因子参与的过程，故氯化钴诱导肿瘤细胞凋亡的详细机制仍需进一步研究。
参考文献
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