基于LAMP的好氧反硝化细菌筛选及其反硝化性能的研究

论文摘要

好氧反硝化过程是反硝化菌在有氧的条件下,将硝态氮或亚硝态氮依次还原为氮气的过程。好氧反硝化细菌在不同氮形式还原过程中依次利用4种金属还原酶催化完成,包含硝酸盐在周质硝酸盐还原酶Nap或膜质硝酸盐还原酶Nar的作用下还原为亚硝酸盐,亚硝酸盐在亚硝酸盐还原酶Nir的作用下还原为NO,NO在亚硝酸盐氧化还原酶Nor的作用下还原为N2O,N2O在氧化亚氮还原酶Nos的作用下还原为N2。亚硝酸盐还原酶控制的反硝化过程是脱氮的关键性限速步骤、氧化亚氮还原酶是反硝化过程还原为氮气的最后一步,所以通过LAMP体系检测nir S、nir K和nosZ基因可以从分子生物学角度深入研究好氧反硝化菌群特性和反硝化过程氮素的转化规律,进而可以优化好氧反硝化菌的反硝化能力,为污废水环境治理提供便捷的菌株筛选方法和菌种资源,为生物脱氮科研与生产生活提供数据支撑。环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP）是一种新型的体外扩增DNA技术,即用2对（或3对）特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下（60～65℃）,60 min就能完成核酸扩增的一种生化检测方法,较之其他常规基因检测技术,LAMP反应体系快速、简易、高特异性及不依赖于昂贵检测设备等优点。为了快捷、精确的筛选海水好氧反硝化菌株,本论文应用LAMP专用软件设计了nir S基因、nir K基因和nosZ基因的LAMP引物,利用特异性的LAMP反应体系,对候选好氧反硝化菌株进行初筛,再用PCR法、产气检测法进行复筛,并对筛选出的反硝化菌株进行了反硝化性能测试和反硝化能力环境因子优化。主要研究结果如下:（1）通过好氧反硝化条件下富集,从南美白对虾种虾培育系统的生物滤池中分离出13株候选菌株,分别编号为KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KFDX5、KFDX6、KFDX7、KWDX1、KWDX2、KWDX3、FJ3-1、FJ3-2和FJ6-1。（2）根据亚硝酸盐还原酶编码基因nir S基因和nir K基因,氧化亚氮还原酶编码基因nosZ基因序列设计LAMP引物,LAMP体系在60℃下反应60 min,通过Gene FinderTM核酸染料直接染色法和琼脂糖凝胶电泳法两种方法对扩增产物进行特异性检测。初步筛选出KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KWDX1、FJ3-1、FJ3-2等7株携带三种基因的反硝化菌株。为了避免通过LAMP筛选的菌株有假阳性,经PCR进一步验证,结果与LAMP筛选的结果一致。通过数字式压差仪进行产气检测三次筛选,筛选出确有气体产生的菌株。综合三步的结果,确认从南美白对虾种虾海水养殖系统中筛选到KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1、F3-2 5株产N2好氧反硝化菌株,这些菌株经16S r RNA基因测序,鉴定KFDX1为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、KFDX2为海角副球菌（Paracoccus homiensis）、KFDX3为产玉米素副球菌（Paracoccus zeaxanthinifaciens）、KWDX1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、FJ3-2为脂解交替假单胞菌（Psudoaltermonus lipolytica）。（3）测定菌株在不同氮源条件下生长和脱氮特性结果表明,筛选出来的含nosZ基因且产气的菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2对亚硝酸氮、硝酸氮、氨氮和总氮的去除效果良好,去除率分别达到99%、90%、97%和90%以上,最大去除速率分别可高达4.9 mg/（L·h）、4.03 mg/（L·h）、4.15 mg/（L·h）和6.03 mg/（L·h）。去除速率明显高于不含该基因的菌株KFDX4、FJ3-1。以氮源为唯一变量时,5株菌株对亚硝酸氮的去除效果优于氨氮,优于硝酸氮。（4）环境条件对5株菌株生长和脱氮的影响实验结果显示,不同菌株生长和脱氮对环境的要求各异,对环境因素的耐受力也不同。5株菌株在温度为22℃～40℃,p H值在6.0～9.0,盐度为20～50,C/N为4～24,以柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖、乙醇、醋酸钠为唯一碳源的条件范围内均能保持良好生长并能维持较高的脱氮特性。（1）菌株KFDX1最佳生长条件为温度34℃、p H 7.0、盐度30g·L-1、C/N为20、碳源为乙醇;最佳脱氮条件为温度22℃、p H 7.0、盐度30 g·L-1、C/N为20、碳源为蔗糖或柠檬酸钠。24h亚硝酸盐去除率可达94%,硝酸盐去除率可达95%。（2）菌株KFDX2最佳生长条件为温度28℃、p H 7.5、盐度50 g·L-1、C/N为20、碳源为乙醇;最佳脱氮条件为温度40℃、p H 8.5和6.0、盐度50 g·L-1、C/N为20、碳源为葡萄糖。24h亚硝酸盐去除率为91%,硝酸盐去除率为93%。（3）菌株KFDX3最佳生长条件为温度28℃、p H 7.5、盐度50 g·L-1、C/N为16、碳源为乙醇;最佳脱氮条件为温度28℃、p H 7.5、盐度50 g·L-1、C/N为16、碳源为葡萄糖或柠檬酸钠。24h亚硝酸盐去除率为83%,硝酸盐去除率为88%。（4）菌株KWDX1最佳生长条件为温度28℃、p H 8.0、盐度20 g·L-1、C/N为30、碳源为乙醇;最佳脱氮条件为温度22℃、p H 7.5、盐度20 g·L-1、C/N为30、碳源为蔗糖或柠檬酸钠。24h亚硝酸盐去除率为87%,硝酸盐去除率为88%。（5）菌株FJ3-2最佳生长条件为温度34℃、p H 7.5、盐度25 g·L-1、C/N为24、碳源为乙醇;最佳脱氮条件为温度22℃、p H 6.5、盐度0 g·L-1、C/N为12、碳源为葡萄糖。24h亚硝酸盐去除率为92%,硝酸盐去除率为89%。本论文建立的快捷、精准好氧反硝化菌株筛选方法及获得的高效菌株对改进反硝化菌株的筛选技术和高氮废水的脱氮净化具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 研究的背景及意义
•   1.2 氮代谢过程及参与细菌研究进展
•     1.2.1 氮代谢过程
•     1.2.2 反硝化细菌研究进展
•   1.3 反硝化过程及功能基因研究进展
•     1.3.1 厌氧反硝化作用
•     1.3.2 好氧反硝化作用
•     1.3.3 反硝化途径功能基因
•     1.3.4 基因检测技术
•   1.4 脱氮细菌的筛选方法与应用研究进展
•   1.5 环介导等温扩增技术
•     1.5.1 LAMP技术研究进展
•     1.5.2 LAMP技术的应用
•   1.6 研究内容及目的
• 第二章 好氧反硝化细菌菌株的富集与分离
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 样品来源
•     2.2.2 试剂与仪器
•     2.2.3 培养基
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 菌株的富集培养
•     2.3.2 菌株的分离、纯化
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 好氧反硝化培养基分离结果
•   2.5 讨论
•   2.6 本章小结
• 第三章 基于LAMP技术的好氧反硝化细菌筛选与鉴定
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 实验菌株
•     3.2.2 试剂与仪器
•     3.2.3 培养基
•     3.2.4 nirS、nirK、nosZ基因引物设计与合成
•     3.2.5 LAMP反应体系
•     3.2.6 好氧反硝化菌株的LAMP初步筛选
•     3.2.7 好氧反硝化菌株的PCR二次筛选
•     3.2.8 好氧反硝化菌株的产气检测三次筛选
•     3.2.9 好氧反硝化菌株的鉴定
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 LAMP扩增产物的检测结果
•     3.3.2 PCR二次筛选结果
•     3.3.3 反硝化菌株的产气检测筛选
•     3.3.4 16SrRNA基因测序和系统发育分析
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 第四章 好氧反硝化菌株反硝化能力测定
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 样品来源
•     4.2.2 试剂与仪器
•     4.2.3 反硝化能力测试培养基
•     4.2.4 菌株反硝化性能测定
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 亚硝酸钾为唯一氮源菌株的脱氮能力
•     4.3.2 硝酸钾为唯一氮源菌株的脱氮能力
•     4.3.3 硫酸铵为唯一氮源菌株的脱氮能力
•     4.3.4 复合氮源菌株的脱氮能力
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 第五章 好氧反硝化菌株的环境适应性研究
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 菌株来源
•     5.2.2 试剂与仪器
•     5.2.3 反硝化能力测试培养基
•     5.2.4 不同环境因子对菌株生长和脱氮效果的影响
•   5.3 实验结果
•     5.3.1 不同环境条件对菌株KFDX1生长和脱氮性能的影响
•     5.3.2 不同环境条件对菌株KFDX2生长和脱氮性能的影响
•     5.3.3 不同环境条件对菌株KFDX3生长和脱氮性能的影响
•     5.3.4 不同环境条件对菌株KWDX1生长和脱氮性能的影响
•     5.3.5 不同环境条件对菌株FJ3-2生长和脱氮性能的影响
•   5.4 讨论
•   5.5 本章小结
• 第六章 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间论文发表及科研情况
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘启臣

导师: 徐爱玲

关键词: 好氧反硝化菌,环介导等温扩增,基因,快速筛选,生物脱氮

来源: 青岛理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 青岛理工大学

分类号: X172;X703

DOI: 10.27263/d.cnki.gqudc.2019.000204

总页数: 83

文件大小: 3849k