全氟癸酸对小鼠原代肾细胞及相关蛋白毒性效应与机理的研究

论文摘要

全氟化合物（PFCs）具有良好的物理化学特性,被广泛地应用于纺织、包装、地毯、农业等领域。但PFCs作为一种持久性有机污染物,具有很高的稳定性。除此之外,PFCs还有很强的生物富集性和生物蓄积性,对环境,生物和人体都有极大的危害。PFCs进入人体后会诱发一系列的毒性作用,很多文献在动物、细胞和分子层面都有报道。研究发现,PFCs的碳链越长,毒性越大。全氟癸酸（PFDA）作为一种长碳链的PFCs,其毒性效应不容忽视。本文从细胞水平上评价PFDA诱发小鼠原代肾细胞氧化损伤及凋亡的毒性效应与机理,并从分子层面研究了 PFDA与氧化应激关键酶超氧化物歧化酶（SOD）、抗凋亡酶溶菌酶（LYZ）和运输蛋白人血清白蛋白（HSA）的结合方式以及PFDA对三种蛋白结构和功能的影响。文章主要分为以下六个部分。第一部分:简要介绍了 PFCs的污染情况和毒性作用以及本文所使用的主要技术和方法,并对研究的内容和意义进行了介绍。第二部分:选取小鼠原代肾细胞为研究对象,通过细胞活力检测,细胞内氧化活性物质（ROS）检测以及细胞凋亡等指标来评价PFDA暴露对小鼠原代肾细胞的毒性作用与机理。研究表明,随着PFDA浓度的增加,PFDA对肾细胞的毒性逐渐增大,ROS的产生量明显增加,当PFDA浓度为400μM时,ROS的产生量增加到了空白对照组的3.2倍之多,细胞内积累了过量的ROS无法清除,对小鼠肾细胞产生毒性作用,最终降低了细胞活力,导致细胞凋亡。其中总凋亡细胞和早期凋亡细胞与PFDA浓度之间存在明显的剂量-效应关系。第三部分:选取氧化应激关键酶SOD为研究对象,以光谱学和热力学为基础,通过模拟生理条件下的酶活性测定和分子模拟,探讨PFDA对溶菌酶结构和功能的影响。研究结果表明,PFDA可与SOD在范德华力和分子间氢键力的共同作用下自发地结合。结合位点位于SOD的分子表面,PFDA的羧基与Val-A98形成氢键,键长为3.11 A。光谱学实验结果表明,随着PFDA浓度的升高,SOD骨架结构收缩,二级结构发生较大变化。当PFDA与SOD的摩尔比为8:1时,β-折叠的含量下降至34.6%,使SOD分子祛折叠。PFDA的表面活性剂性质使SOD产生了荧光敏化效应,但并未明显改变SOD中酪氨酸周围的微环境。第四部分:选取抗凋亡酶LYZ为研究对象,以光谱学和热力学为基础,通过模拟生理条件下的酶活性测定和分子模拟,研究了 PFDA对LYZ结构和功能的影响。结果表明,PFDA和LYZ可以在范德华力和氢键作用下自发地结合,结合常数（K）为1.14 × 104 M-1 二者的相互作用导致LYZ分子多肽链的收缩,降低了 LYZ中芳香氨基酸周围微环境的疏水性。同时,PFDA浓度的升高使α-螺旋的含量极大地降低,改变了 LYZ的二级结构。分子模拟结果表明,PFDA更倾向于在酶活性中心处与Ser-50和Trp-62结合,形成长度分别为2.76 A和2.68 A的氢键。PFDA与底物在活性位点的竞争效应以及LYZ结构的改变导致LYZ活性显著降低。此外,PFDA的表面活性剂性质导致LYZ的荧光增敏。第五部分:这一部分探讨了 PFDA对血液中运输蛋白HSA的毒性机制,建立了 PFDA与HSA的相互作用模式。结果表明PFDA可与HSA结合形成复合物同时诱导HSA荧光增敏。光谱学结果显示,PFDA对HAS的多肽链结构以及Trp-214周围的微环境有轻微的影响。此外,当PFDA的浓度升至4× 10-4M时,HSA的相对酯酶活性降低超过60%。热力学实验结果显示,二者相互作用的吉布斯自由能（△G）,焓变（△H）和熵变（AS）分别为-7.2683 kcal.mol-1,-2.718×104 cal.mol-1和-66.8 cal·mol-1·K-1,这一结果表明PFDA与HSA的结合是由范德华力和氢键驱动的自发反应。此外,通过分子模拟确定了具体的结合位点,结果显示PFDA与Tyr-411通过氢键结合,键长为2.64 A,与热力学分析和酶活性的研究结论一致。第六部分:结合各部分的实验结果,比较PFDA对三种蛋白质产生的毒性效应与机理的异同。由于PFDA的表面活性剂性质,三种蛋白质的荧光均呈现出不同程度的增强趋势;有所不同的是,PFDA降低了 HSA中Trp周围微环境的流动性,增加了其疏水性,但对于SOD和LYZ中生色团氨基酸微环境的影响不大;在分子骨架结构方面,PFDA对于LYZ的影响相对于SOD及HSA更大;PFDA对于SOD和LYZ分子中二级结构的影响较大,但对HSA分子中的二级结构影响不明显;在实验条件下,PFDA对于SOD酶活性影响不大,但对LYZ和HSA的活性产生了明显的抑制作用,且在高浓度条件下更为明显,产生这种现象的原因是PFDA结合在了 LYZ和HSA的活性位点处,但PFDA与LYZ的结合位点位于LYZ分子的表面,而非活性中心。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第1章 绪论
•   1 全氟化合物的介绍
•   2 全氟化合物的毒性研究进展
•   3 研究方法与技术
•     3.1 细胞水平研究方法
•     3.2 分子水平研究方法
•       3.2.1 荧光发射光谱法
•       3.2.2 同步荧光光谱法
•       3.2.3 红边激发荧光位移法
•       3.2.4 共振光散射光谱法
•       3.2.5 紫外-可见吸收光谱法
•       3.2.6 圆二色性光谱法
•       3.2.7 相对酶活性实验
•       3.2.8 等温滴定量热法
•       3.2.9 分子模拟技术
•   4 论文的研究内容及意义
•     4.1 研究内容
•     4.2 研究意义
• 第2章 全氟癸酸诱发小鼠原代肾细胞氧化损伤及凋亡的研究
•   1 前言
•   2 实验材料及方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 实验步骤及方法
•       2.2.1 小鼠原代肾细胞的分离获取及PFDA暴露实验
•       2.2.2 细胞活力测定实验
•       2.2.3 细胞内活性氧含量测定实验
•       2.2.4 细胞凋亡测定实验
•   3 结果与讨论
•     3.1 PFDA对原代肾细胞活力的影响
•     3.2 PFDA诱导细胞ROS的变化
•     3.3 PFDA对肾细胞凋亡的影响
•   4 本章小结
• 第3章 全氟癸酸与氧化应激关键酶的作用研究
•   1 前言
•   2 实验材料及方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 实验方法及步骤
•       2.2.1 光谱实验及酶活性实验中实验样品的配制
•       2.2.2 荧光光谱检测
•       2.2.3 紫外吸收光谱检测
•       2.2.4 圆二色性光谱检测
•       2.2.5 SOD酶活性实验
•       2.2.6 等温量热滴定技术
•       2.2.7 分子模拟
•   3 结果与讨论
•     3.1 PFDA诱发SOD荧光敏化效应及机理
•     3.2 PFDA对SOD中氨基酸微环境的影响
•     3.3 PFDA对SOD分子结构的影响
•       3.3.1 PFDA对SOD分子骨架结构的影响
•       3.3.2 PFDA对SOD分子二级结构的影响
•     3.4 PFDA对SOD酶活性的影响
•     3.5 PFDA与SOD结合的热力学参数及具体结合模型
•       3.5.1 PFDA与SOD结合的热力学数据
•       3.5.2 PFDA与SOD的结合模型
•   4 本章小结
• 第4章 全氟癸酸与抗凋亡蛋白的作用研究
•   1 前言
•   2 实验材料及方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 实验方法及步骤
•       2.2.1 光谱实验及酶活性实验中实验样品的配制
•       2.2.2 荧光光谱检测
•       2.2.3 紫外吸收光谱检测
•       2.2.4 圆二色性光谱检测
•       2.2.5 LYZ酶活性实验
•       2.2.6 等温量热滴定技术
•       2.2.7 分子模拟
•   3 结果与讨论
•     3.1 PFDA诱发LYZ荧光敏化效应及机理
•       3.1.1 实验体系颗粒大小的变化
•       3.1.2 PFDA对LYZ荧光发射光谱的影响
•     3.2 PFDA对氨基酸微环境的影响
•       3.2.1 PFDA对LYZ同步荧光光谱的影响
•       3.2.2 PFDA对LYZ中色氨酸周围微环境的影响
•     3.3 PFDA对LYZ分子结构的影响
•       3.3.1 PFDA对LYZ分子骨架结构的影响
•       3.3.2 PFDA对LYZ分子二级结构的影响
•       3.3.3 PFDA对LYZ三维荧光光谱的影响
•     3.4 PFDA对LYZ酶活性的影响
•     3.5 PFDA与LYZ结合的热力学参数及具体结合模型
•       3.5.1 PFDA与LYZ结合的热力学数据
•       3.5.2 PFDA与LYZ的结合模型
•   4 本章小结
• 第5章 全氟癸酸与血液运输蛋白的作用研究
•   1 前言
•   2 实验材料及方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 实验方法及步骤
•       2.2.1 光谱实验及HSA酯酶活性实验中实验样品的配制
•       2.2.2 荧光光谱检测
•       2.2.3 紫外可见吸收光谱检测
•       2.2.4 圆二色性光谱检测
•       2.2.5 HSA酯酶活性实验
•       2.2.6 等温量热滴定技术
•       2.2.7 分子模拟
•   3 结果与讨论
•     3.1 PFDA诱发HSA荧光敏化效应及机理
•       3.1.1 PFDA对HSA共振光散射光谱的影响
•       3.2.2 PFDA对HSA荧光发射光谱的影响
•     3.2 PFDA对氨基酸微环境的影响
•       3.2.1 PFDA对HSA同步荧光光谱的影响
•       3.2.2 PFDA对Trp-214周围微环境的影响
•     3.3 PFDA对HSA分子结构的影响
•       3.3.1 PFDA对HSA分子骨架结构的影响
•       3.3.2 PFDA对HSA分子二级结构的影响
•       3.3.3 PFDA对HSA三维荧光光谱的影响
•     3.4 PFDA对HSA酯酶活性的影响
•     3.5 PFDA与HSA结合的热力学参数及具体结合模型
•       3.5.1 PFDA与HSA结合的热力学数据
•       3.5.2 PFDA与HSA的结合模型
•   4 本章小结
• 第6章 全氟癸酸对三种蛋白质毒性效应的比较
• 第7章 研究结论与展望
•   1 主要结论
•   2 论文的创新点
•   3 论文的不足及研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间的科研情况及奖励
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高思晨

导师: 刘汝涛

关键词: 全氟癸酸,细胞毒性,超氧化物歧化酶,溶菌酶,人血清白蛋白

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 山东大学

分类号: X592;X171.5

总页数: 93

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