农杆菌介导的茯苓基因沉默体系的建立

论文摘要

茯苓（Wolfiporia cocos）是我国重要的药用真菌,其菌核是我国传统中药材。茯苓菌核及活性成分形成相关的功能基因组学研究对于茯苓产业发展非常重要。近年来茯苓基因组测序工作的完成,为其在菌核发育及活性成分等方面的研究提供了分子信息基础。然而,茯苓研究中缺乏简便有效的基因功能鉴定体系。因此,本研究旨在构建适用于茯苓基因功能研究的技术体系,开展的主要研究内容及结果如下:（1）对茯苓内源乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因（URA3）、茯苓甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）启动子、NADPH氧化酶相关基因进行了克隆和序列分析,明确了这些基因的序列特征及结构特点。（2）选择具有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300-g为载体骨架。利用茯苓内源乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因（URA3）作为反向筛选标记,以该基因的功能结构保守区域的反向互补片段为干扰片段,分别构建了以香菇Legpd和Leactin为双向启动子的RNAi载体,及以茯苓Wcgpd为单向启动子的RNAi载体。以茯苓栽培菌株靖州28为试验材料,首次采用根癌农杆菌介导转化法侵染茯苓菌丝,经5次潮霉素抗性平板筛选后分别获得了稳定生长的11个异源香菇双向启动子的RNAi转化子,和10个同源茯苓单向启动子的RNAi转化子。对获得的转化子进行实时荧光定量PCR分析发现,有10个异源双向启动子的RNAi转化子和3个同源单向启动子的RNAi转化子基因URA3表达量较野生型菌株下调显著。进一步将部分下调显著的两种类型转化子分别接种于含10μg/mL5’-FOA的CYM培养基上培养,结果表明,这些RNAi转化子均能生长并且形成菌落,但野生型菌株不能生长。因此认为,基因URA3的表达已被成功干扰。（3）通过比较两种不同来源启动子的RNAi转化子,发现异源香菇的启动子也适用茯苓的转化试验,并且双向启动子的RNAi转化子的沉默效果在一定程度上优于单向启动子的RNAi转化子。同时,本研究也比较了不同培养基培养的受体材料对转化效率的影响,结果表明,茯苓菌丝的不同培养方式可能会对转化效率有影响。（4）以茯苓NADPH氧化酶相关基因Nox-R功能结构保守区域的反向互补片段为干扰片段,构建了以香菇Legpd和Leactin为双向启动子的RNAi载体,并进行了遗传转化,经过5次潮霉素抗性平板的筛选后获得了5个稳定生长的RNAi转化子。实时荧光定量PCR分析发现,其中有3个转化子Nox-R基因表达量较野生型菌株下调显著。上述结果表明,本课题成功构建了农杆菌介导的茯苓基因沉默体系,为今后茯苓基因重组、插入突变等基因功能的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
•   1.1 茯苓概述
•     1.1.1 茯苓的分类地位及形态
•     1.1.2 茯苓的生态习性与野生资源分布
•     1.1.3 茯苓的食药用与保健价值
•   1.2 茯苓的栽培历史与现状
•   1.3 茯苓的交配型系统及育种技术
•     1.3.1 茯苓交配型系统
•     1.3.2 茯苓育种技术发展
•   1.4 根癌农杆菌介导的食用菌遗传转化的研究
•     1.4.1 食用菌遗传转化体系的研究现状
•     1.4.2 根癌农杆菌介导转化法在食用菌中用的启动子
•     1.4.3 根癌农杆菌介导转化法在食用菌中常用的筛选标记
•     1.4.4 根癌农杆菌介导转化法的影响因素
•   1.5 RNA干扰技术在食用菌中的应用
•     1.5.1 RNA干扰技术
•     1.5.2 RNA干扰在食用菌基因功能研究中的应用
•   1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 供试菌株
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 供试培养基
•     2.1.5 引物信息
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 茯苓遗传转化相关基因的克隆及序列分析
•     2.2.2 茯苓沉默载体构建
•     2.2.3 农杆菌介导的茯苓遗传转化体系的建立
•     2.2.4 RNAi转化子的筛选和鉴定
•     2.2.5 qRT-PCR分析
•     2.2.6 RNAi转化子表型观测与分析
• 3 结果与分析
•   3.1 茯苓遗传转化相关基因的克隆及序列分析
•     3.1.1 茯苓URA3 基因的克隆及序列分析
•     3.1.2 茯苓GAPDH基因的克隆及启动子的序列分析
•     3.1.3 茯苓NADPH氧化酶基因Nox-R的克隆及序列分析
•   3.2 茯苓菌丝对潮霉素的敏感性试验
•   3.3 茯苓菌丝对头孢噻肟霉素的敏感性试验
•   3.4 茯苓菌丝对5’-氟-乳清酸的敏感性试验
•   3.5 茯苓URA3 基因的RNAi干扰
•     3.5.1 双向启动子沉默载体的转化
•     3.5.2 单向启动子沉默载体的转化
•   3.6 茯苓Nox-R基因的RNAi干扰
•     3.6.1 茯苓Nox-R基因沉默载体的构建
•     3.6.2 RNAi转化子的筛选与鉴定
•     3.6.3 qRT-PCR分析
• 4 讨论
•   4.1 香菇双向启动子载体沉默效果的评价
•   4.2 受体材料的不同培养方式对转化效率的影响
•   4.3 茯苓单向启动子载体沉默效果的评价
•   4.4 茯苓基因沉默体系在NADPH氧化酶基因Nox-R中的初步应用
• 5 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈乃瑶

导师: 徐章逸

关键词: 茯苓,根癌农杆菌,沉默体系,乳清酸核苷单磷酸脱羧酶,氧化酶

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 华中农业大学

分类号: Q943.2;S567.32

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000246

总页数: 74

文件大小: 2738K

下载量: 145