一、小鼠胚胎卵巢体外无血清培养体系的建立（论文文献综述）
王璐[1]（2019）在《淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究》文中研究表明干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,具有十分广阔的应用前景,已被广泛应用至多种疾病的临床研究中,但是临床上移植入体内的干细胞存活率低,限制了其推广应用。因此,亟需新的治疗策略改进干细胞抵御体内恶劣微环境的能力。天然药物独具优势,前期实验发现淫羊藿素（icaritin,ICT）预处理后的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗急性肝衰竭大鼠,死亡率进一步降低,肝脏病理、肝功能得到进一步改善,但是内在机理尚不清楚。预实验发现ICT可以增加体外培养的hUC-MSCs的细胞活力,调节多种细胞因子的分泌,并减少细胞的凋亡,电镜下可见ICT减少了自噬小体包裹的线粒体数量,因此,本研究将从细胞凋亡与线粒体自噬入手,探索淫羊藿素影响人脐带间充质干细胞的机制,为中药联合干细胞疗法提供理论依据。目的:本研究首先通过文献综述,为实验提供理论支持;随后在体外采用无血清培养部分模拟体内微循环障碍的环境,使用ICT干预hUC-MSCs,探索其是否具有抗凋亡作用,并深入研究是否通过HGF（肝细胞生长因子）/c-Met通路发挥作用;观察ICT能否干预hUC-MSCs的线粒体自噬过程;同时采用蛋白质谱,分析ICT预处理后的hUC-MSCs的差异表达蛋白,并进行GO分析、KEGG分析、蛋白互作分析等生物信息学分析,评估淫羊藿素参与的生物学过程。方法:人脐带间充质干细胞无血清培养72小时作为基本的造模方式,模拟微循环障碍的体内环境。不同浓度的ICT干预造模细胞,用MTS法测定其0D值,筛选最佳处理浓度。BrdU掺入试验检测Control组（正常培养组）、Serum free组（无血清培养组）、ICT组（淫羊藿素组）、HGF组（肝细胞生长因子组）的细胞增殖率。ELISA法检测ICT促进hUC-MSCs的HGF分泌情况。WB与qRT-PCR法检测ICT影响hUC-MSCs的c-Met受体表达情况。转染构建c-Met+MSCs,通过qRT-PCR和WB检验其转染效率。使用CCK8法筛选c-Met受体抑制剂克唑替尼（crizotinib）的最佳作用浓度。采用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测,评估各组细胞凋亡率。qRT-PCR与WB检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Bax的表达。MTS法检测不同浓度的自噬抑制剂3MA对造模细胞的影响。使用qRT-PCR、WB以及免疫荧光显微镜检测线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基II（MT-C02）、自噬相关蛋白LC3B的表达情况。透射电镜观察各组细胞的超微结构,重点观察其线粒体自噬水平。采用qRT-PCR筛选ICT干预hUC-MSCs线粒体自噬的相关通路。使用JC-1膜电位检测试剂盒检测膜电位情况。采用蛋白质谱进行各组细胞差异蛋白的生物信息学分析。结果:1.不同浓度的淫羊藿素处理无血清培养hUC-MSCs,各处理浓度均提高了其细胞活力,但是仅50ng/ml（0.1uM）、100ng/ml具有统计学意义（P<0.05）。选择50ng/ml为最佳处理浓度进行后续实验。BrdU检测显示较Control组,Serum free组增殖率下降（P<0.05）,而使用ICT或者HGF均提高了细胞增值率（P<0.05）。2.人脐带间充质干细胞本身可分泌HGF,也表达HGF的受体c-Met,而ICT能够促进其表达更高水平的HGF与c-Met受体（P<0.05）。构建c-Met+MSCs后,WB与qRT-PCR法证实了基因转染成功。根据细胞抑制率,筛选4 u M为克唑替尼（c-Met受体抑制剂）的最佳处理浓度。MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,c-Met+MSCs的细胞凋亡率显着降低（P<0.01）,克唑替尼处理后,细胞凋亡率显着增高（P<0.01）,提示HGF/c-Met通路对于MSCs具有抗凋亡作用。WB显示,对比MSCs组,c-Met+MSCs组Bcl-2的表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,克唑替尼则使Bcl-2蛋白水平降低,Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示HGF/c-Met通路通过调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。3.MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,ICT或HGF处理后,MSCs凋亡率显着降低（P<0.05）。当使用c-Met受体抑制剂克唑替尼时,拮抗了 ICT的抗凋亡作用,差异有统计学意义（P<0.01）。这表明克唑替尼可以抑制ICT对MSCs的保护作用,ICT对MSCs的抗凋亡作用与HGF/c-Met通路相关。WB显示,ICT或HGF处理后的MSCs的Bcl-2表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,对比ICT组,加用克唑替尼后可使Bcl-2蛋白水平降低,使Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示ICT通过HGF/c-Met通路调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。4.低浓度的自噬抑制剂3-MA对造模细胞的活性具有促进作用（P<0.05）,而高浓度的自噬抑制剂3-MA抑制了细胞活性（P<0.01）。提示无血清培养条件下,适度的抑制细胞自噬有利于细胞的存活,而过度的抑制细胞自噬则会降低细胞活力,不利于细胞存活。5.与Control组比较,Serum free组MSCs的线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ（MT-C02）均会减少,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率提高,线粒体膜电位降低,提示线粒体自噬水平被上调,电镜可见细胞内“线粒体自噬体”（被自噬小体包裹的线粒体）显着增多,损伤线粒体增加,细胞形态不佳,证实了无血清培养增加了线粒体自噬;而ICT或者HGF干预后上述线粒体蛋白表达增加,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率降低,线粒体膜电位升高,提示线粒体自噬水平被下调。电镜可见胞内“线粒体自噬体”减少,损伤线粒体减少,细胞形态得到一定的改善,证实了ICT和HGF均减少了线粒体自噬。6.采用qRT-PCR进行Pink1/Parkin通路,FUNDC1通路以及Bnip3/Nix通路的筛选,结果如下:Pink1、Bnip3的mRNA与前述线粒体自噬趋势相符,Nix、FUNDC1的mRNA呈现出相矛盾的趋势。7.蛋白质谱分析:通过GO分析,发现Control组与Serum free组的差异蛋白,以及ICT组与Serum-free组之间,HGF组与Serum free组之间的差异蛋白,均参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程（P<0.05）。对ICT组与Serum free组的差异蛋白进行分析,AKT1位于蛋白互作中心节点位置,KEGG分析PI3K-AKT通路具有统计学意义,可作为研究的重点通路。对于HGF组与Serum free组之间的差异蛋白进行分析,筛选出NF-κ B通路作为研究重点通路。结论:1.淫羊藿素能够通过HGF/c-Met通路降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的凋亡率,与调节Cleaved Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达水平有关。2.淫羊藿素或肝细胞生长因子均可降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的线粒体自噬水平,减少损伤线粒体数目,改善细胞形态,增加线粒体蛋白tomm20、timm23、MTC02的表达,提高线粒体膜电位。3.蛋白质谱分析发现淫羊藿素或肝细胞生长因子介导的差异蛋白参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程,对于ICT,PI3K-AKT通路可作为研究重点通路,对于HGF,NF-κ B通路可作为研究重点。
周乃珍[2]（2019）在《基于P（MVE-alt-MA）的凝胶用于卵巢癌干细胞样细胞富集的研究》文中提出癌干细胞（CSCs）与癌症转移、侵袭、恶性转变等行为相关,被普遍认为是化/放疗抗性和癌症复发的重要根源。为了更加针对性地研究其作用机制,需要分离或富集出CSCs。近年来随着三维细胞培养技术的发展,水凝胶因具有广阔的生物医学应用前景而成为当下研究的热点之一。细胞外基质相当于一个多组分的凝胶体系。本论文以甲基乙烯基醚-马来酸交替共聚物[P（MVE-alt-MA）]为主要原料,构造了基于P（MVE-alt-MA）的三个可控的凝胶体系,仿造细胞外基质结构和性质的特点,从基质的硬度、形貌、成分及粘附性等方面进行调节,试图揭示这些因素对卵巢癌CSCs干性表达的影响。凝胶的结构通过扫描电镜、红外、溶胀率和流变等手段进行了充分的表征。首先构建最简单的聚乙二醇（PEG）交联的P（MVE-alt-MA）凝胶体系（简写为PEMM）,并在此基础上加入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）以仿造细胞外基质中胶原的性质。另外,加入海藻酸盐以模拟细胞外基质中透明质酸,从组分上更进一步地仿造细胞外基质的性能。应用这些仿细胞外基质的可控的凝胶体系实现了对单一因素进行精确且独立的调控,并研究其对CSCs干性表达的影响,最终筛选出CSCs干性基因高表达的细胞进行体内成瘤实验,初步探究肿瘤侵袭、迁移、恶性转变等信号通路的作用机制。具体而言,主要工作内容包括:（1）PEG交联的P（MVE-alt-MA）凝胶的弹性模量对卵巢癌干细胞样细胞富集的影响。通过控制交联密度制备两种硬度的PEMM凝胶（12 k Pa和97 k Pa）,随着交联度的增加,凝胶的网络结构越紧密,弹性模量越大,溶胀率越低。细胞的增殖和活力检测证实了该凝胶良好的生物相容性,并且凝胶的特性利于SK-OV-3卵巢癌细胞的球状体形成。联合多种CSCs标志物及耐药性检测分析显示凝胶培养的球状体细胞获得一定的癌干细胞样特性,耐药性增强,且较软凝胶中尤为显着。同时肿瘤侵袭、迁移以及恶性转变等信号通路相关基因的表达揭示了基质硬度参与调节上皮间充质转化（EMT）、白细胞介素-6（IL-6）以及Wnt等信号通路,影响卵巢癌侵袭性、EMT以及非CSCs向CSCs转变的能力。相对2D培养板及97 k Pa硬基质来说,12 k Pa软基质、大孔径形貌、高溶胀性凝胶PEMM-1中卵巢癌细胞的干性及恶性程度更高。此项研究为后续工作奠定基础,为研究基质因素对癌干细胞样细胞富集的影响提供了平台。（2）PEG交联的P（MVE-alt-MA）凝胶中RGD含量对卵巢癌干细胞样细胞富集的影响。在PEMM凝胶基础上通过控制RGD含量制不同表面粘附特性的凝胶,发现细胞行为受基质表面RGD含量的影响,低RGD含量表面培养的3D细胞聚集体获得一定的癌干细胞样特性,耐药性增强,而高RGD含量表面的细胞铺展明显,药敏性增高。另外低浓度的RGD并未改变基质硬度对CSCs富集的效应关系,而基质硬度的差异对癌细胞行为的影响在高浓度的RGD凝胶中不再明显。并且较硬凝胶中RGD的存在对于癌细胞行为的影响没有软凝胶中的显着,基质硬度影响了RGD的功能发挥。卵巢癌细胞与基质表面的RGD结合,涉及到基质表面细胞的粘附程度影响其形态和分化状态,进而影响其癌细胞干性的表达以及EMT等过程。高RGD表面Snail、MMP9、IL-6和Wnt1下调,影响了卵巢癌侵袭性、CSCs干性的获得及非CSCs的转化相关信号通路。说明了RGD含量和基质硬度共同作用于CSCs干性、EMT、IL-6和Wnt通路的表达。（3）PEG交联的P（MVE-alt-MA）和海藻酸盐双网络凝胶对卵巢癌干细胞样细胞富集的影响。制备了三种双网络凝胶,其由PEMM形成的第一重网络以及阳离子（Sr2+、Ca2+或Fe3+）交联的海藻酸盐形成的第二重网络（Sr Alg、Ca Alg或Fe Alg）所构成。对双网络凝胶的硬度、形貌和成分进行系统的研究,以了解其对CSCs富集的影响。经检测发现仅PEMM/Fe Alg凝胶可供细胞长期生长增殖,且利于SK-OV-3细胞的球状体形成。同时PEMM/Fe Alg凝胶培养的球状体细胞获得一定的癌干细胞样特性,耐药性增强,且PEMM-I/Fe Alg凝胶尤为显着,而不同时间点CSCs标志物的变化也说明了其各自的作用阶段。基质成分、硬度和形貌共同参与调节EMT、IL-6以及Wnt等信号通路,影响卵巢癌的侵袭性以及非CSCs向CSCs的转化。PEG交联的P（MVE-alt-MA）凝胶中海藻酸盐的加入既能改变基质成分,又可通过调控双网络结构进而引入离子并改变基质硬度和形貌,是较为理想的研究模型。（4）基于P（MVE-alt-MA）的凝胶富集的卵巢癌干细胞样细胞的致瘤性评价。通过从凝胶基质的成分、硬度、形貌及粘附特性等方面对卵巢癌干细胞样细胞富集影响的研究,初步筛选出利于CSCs富集的培养环境,并从中选取CSCs标志物表达较高、耐药性较强、恶性通路激活较显着的PEMM-1和PEMM-I/Fe Alg凝胶培养的细胞进行致瘤性评价。由接种的细胞量、成瘤所需的时间以及瘤体的重量和体积表明,即便凝胶培养组的细胞接种量（1×105）比2D对照组的（1×106）少一个数量级,但其成瘤较快,瘤体也更大,且CSCs干性的表达依然增强,进一步证实了基于P（MVE-alt-MA）的凝胶富集的癌干细胞样细胞中CSCs比例的增高。综上所述,本研究构造仿细胞外基质的不同种类的凝胶体系,系统探讨了凝胶的各种因素对肿瘤细胞行为的影响,进而达到对CSCs的富集,为体外肿瘤病理分析提供了更多的研究模型和研究平台。
李天达[3]（2012）在《DA品系大鼠胚胎干细胞系的建立及多能性检测》文中进行了进一步梳理胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs）是一类来源于哺乳动物囊胚阶段内细胞团的多能性细胞。自从1981年大类首次成功建立了第一株小鼠胚胎干细胞以来,由于其能够在体外无限扩增,并且具有发育的多能性,所以利用胚胎干细胞在基因功能的研究,基因修饰,以及细胞治疗和临床应用等都有广阔的应用前景。大鼠是第一种用于科学研究的哺乳动物。由于大鼠体型适中,并且与小鼠相比其生理调节和药理反应等方面与人类的相关性更近,因此在过去的150年间,大鼠被作为动物模型被广泛地应用于生理学、移植医学、免疫学、遗传学、神经科学、癌症和老化等领域的研究,尤其是某些特殊疾病,例如神经疾病和心血管疾病的研究更具有优势。然而,在小鼠胚胎干细胞建立后的二十几年中,人们一直没有成功的建立起真正的大鼠胚胎干细胞。这就使得大鼠在基因敲除动物模型领域的研究远远落后于小鼠。直到2008年,华人科学家应其龙等利用N2B27并添加抑制因子（3i：CHIR99021,PD184352,SU5402或2i：CHIR99021,PD0325901）的无血清培养体系首次分离得到了具有种系嵌合能力的真正的大鼠ESCs。随后又报道了通过大鼠胚胎干细胞进行基因打靶（Gene targeting）,并成功获得TP53基因敲除大鼠。从而解决了限制大鼠转基因模型研究的瓶颈。本研究使用无血清培养液N2B27并添加抑制因子PD0325901,CHIR99021以及Lif的培养体系,从DA品系大鼠囊胚中分离得到了大鼠胚胎干细胞。经鉴定其具有典型的胚胎干细胞形态,呈克隆状,贴壁或悬浮生长：碱性磷酸酶染色结果呈阳性,且具有正常的二倍体细胞核型;经过PCR,免疫荧光染色和Western blot等方法检测,我们所建立的DA大鼠胚胎干细胞表达Oct4,Nanog,Sox2,SSEA-1,FGF4,Rex1和Eras等细胞多能性因子；在体外长期传代培养仍能够维持自我更新的状态。DA大鼠胚胎干细胞在无Lif的条件下可以在体外分化成拟胚体（Embryoid bodys, EBs）;将大鼠胚胎干细胞注射到F344品系的二倍体囊胚中可以得到嵌合体大鼠；研究发现囊胚作为受体相比四细胞胚胎可以得到更高的二倍体嵌合效率；大部分嵌合体大鼠可以存活至成年,并将其与SD品系大鼠交配后能够得到种系嵌合的子代大鼠。因此,上述研究证明了我们所建立的DA大鼠胚胎干细胞是具有种系嵌合能力的、真正的大鼠胚胎干细胞。本研究发现一种新的大鼠胚胎干细胞培养体系（N2B27-4i）,即在经典的无血清N2B27-2i培养液的基础上添加了另外两种抑制因子Y-27632和A-83-01。结果表明N2B27-4i培养体系有利于维持大鼠胚胎干细胞体外长期传代培养,并证明了使用该体系可以显着提高胚胎干细胞的体外增殖速度。研究进一步证明了N2B27-4i培养体系下培养的大鼠胚胎干细胞具有产生嵌合体大鼠和种系嵌合的能力,尤其是相比传统N2B27-2i培养体系可以提高较高代次的大鼠胚胎干细胞产生嵌合体及种系嵌合效率。利用大鼠胚胎干细胞做为供体细胞进行大鼠核移植的研究,结果表明体外培养体系不能支持大鼠核移植胚胎的发育,而利用体内移植的方法可以发育并得到大鼠核移植囊胚。从这些核移植囊胚中可以分离得到核移植胚胎干细胞（ntES）,经鉴定其具有典型的大鼠胚胎干细胞形态,并具有一定的多能性。进一步研究的结果表明,大鼠胚胎干细胞核移植胚胎在体内具有发育到E11.5天的能力,而没有获得发育到期的大鼠胎儿。综上所述,本研究所建立的DA品系大鼠胚胎干细胞系,是具有种系嵌合能力的大鼠胚胎干细胞。同时,也是国内首次得到真正意义的大鼠胚胎干细胞。该研究成果将会极大的促进国内大鼠胚胎干细胞及大鼠转基因模型领域的研究进展,并且在未来将会用于基因敲除大鼠疾病模型的制作,最终为人类疾病研究和药物研发提供优良的大鼠疾病动物模型。
马莉[4]（2011）在《冻融人卵巢组织腔前卵泡的分离及体外培养的研究》文中指出目的本研究采用直接覆盖玻璃化冷冻法冻存人类卵巢组织,解冻后采用酶加机械联合法与培养6天后机械法分别分离人卵巢组织的腔前卵泡,采用藻酸钙三维培养体系,在有、无血清两种培养系统中进行培养,通过比较分离后各级卵泡的存活率,培养前后卵泡直径和雌二醇水平的变化,探讨简捷有效地分离人腔前卵泡的方法及合适的腔前卵泡体外生长发育体系。方法研究对象为23例在我院行腹腔镜或手术切除卵巢良性肿瘤的患者。将收集到的正常人卵巢皮质切成0.5×0.5×1mm3的组织块,直接覆盖玻璃化冷冻,解冻后通过两种方法进行腔前卵泡的分离：一种是胶原酶加机械法联合分离,一种是培养6天后机械法分离,采用藻酸钙三维培养体系在10%胎牛血清（fetal calf serum, FBS）和0.3%牛血清蛋白（bovine serum albumin, BSA）两种培养体系中进行培养,隔天测量腔前卵泡的直径后半量换液,收集废弃的培养液保存于-20℃冰箱,采用电化学发光免疫分析法（electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA）测定雌二醇的水平。采用SPSS17.0对实验数据进行分析。结果1.采用酶加机械联合法对人卵巢组织进行腔前卵泡分离。冷冻前后各级卵泡的存活率无统计学差异（P>0.05）,但始基卵泡的存活率较初、次级卵泡高,表明冷冻保存没有降低各级卵泡的存活率,始基卵泡更能耐受冷冻损伤。2.采用无血清培养体系对腔前卵泡进行培养。组织培养6天后机械法分离腔前卵泡与直接联合法分离腔前卵泡培养6天相比,机械法分离得到的卵泡总数少,但次级卵泡的存活率较高,始基卵泡的存活率较低,差异有统计学意义（P<0.05）。3.解冻后的卵巢组织均采用联合法在有、无血清两种分离液中分离腔前卵泡。BSA组较FBS组回收到的卵泡多,但各级卵泡的存活率无统计学差异（P<0.05）。4.卵巢组织在无血清培养体系培养6天后,采用机械法分离得到腔前卵泡的直径及培养到第10天腔前卵泡的直径显着高于其他3组,差异有统计学意义（P<0.05）。直径的增幅也较其它3组高,差异有统计学意义（P<0.05）。5.卵巢组织在无血清培养体系培养6天后,采用机械法分离得到腔前卵泡分泌的E2水平及培养到第8天、第10天的E2水平显着高于其他3组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.直接覆盖法玻璃化冷冻不影响人卵巢皮质中各级卵泡的存活率2.培养6天后机械法分离回收到次级卵泡的存活率较高,有利于卵泡的后续培养；3.采用无血清分离液可回收到较多的腔前卵泡,且不影响各级卵泡的存活率4.无血清培养体系有助于人腔前卵泡的体外生长发育。
张耀君[5]（2010）在《小鼠和牛腔前卵泡体外分离培养的研究》文中认为哺乳动物卵巢含有大量处于不同发育阶段的卵母细胞,其中多数卵母细胞存在于无腔阶段的卵泡中,但大部分卵泡在无腔阶段（腔前卵泡）中闭锁、退化,没有得到相应的利用,这无疑是动物遗传和育种资源的极大浪费。因此,腔前卵泡的开发无疑是解决这一难题的有效途径。腔前卵泡的体外培养技术已取得了一定的发展,建立了多种培养体系,有其各自的优缺点,研究者一直在摸索合适的培养模型,以期找到一种能够模拟体内卵泡发育的环境条件和模式。影响腔前卵泡体外培养的因素很多,总结以前的成功经验,本研究从其中几个方面进行研究,旨在摸索出一套适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的分离培养体系。1.通过石蜡切片-HE染色技术,研究不同发育时期小鼠卵巢内卵泡的分布状况及发育规律,选择适合发育时期的小鼠,为高效地将腔前卵泡分离出来奠定基础,还可为体外培养过程中卵泡发育结果鉴定的提供参考。研究结果显示：随着小鼠的发育,卵巢发育由最初的无皮质髓质之分到皮质髓质明显可分,卵泡发育从只能看见聚集呈条索状到发育成原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡,直至有腔卵泡的形成。从数量上看,原始卵泡逐渐减少,初次级卵泡逐渐增多,有腔卵泡数量也从无到有从少到多。卵巢由最初的无卵泡发育到有许多大小不等、处于不同发育时期的卵泡、大部分有腔样结构。生后10天～15天的小鼠的腔前卵泡最多,且此时的卵巢结缔组织、脂肪组织等都比较少,易于分离得到数量多且结构完整的腔前卵泡。另外,各级卵泡的分布在卵巢中具有区域性,卵巢皮质的最外层分布有大量的原始卵泡,密度较高,初级卵泡次之,次级卵泡则多数位于最内层,在皮髓的交界处分布相对较多。三级卵泡和成熟卵泡会突出于表皮。从本实验研究结果来看,选择生后15天左右的小鼠的卵巢作为本研究体外分离腔前卵泡的材料比较理想。2.通过腔前卵泡的分离时间、数量、正常率、回收率等评价标准来比较酶-机械结合法和显微分离法这两种分离方法,旨在找出一种适合于从生后15天小鼠卵巢中分离腔前卵泡的有效分离方法,为更好地进行小鼠腔前卵泡的体外培养做好关键的第一步。研究结果显示：酶-机械分离法回收得到腔前卵泡的数量明显多于单纯的机械分离方法（显微分离法）,且选择胶原酶浓度为0.1%分离的数量更多且正常卵泡数多。显微分离法所需时间较长,数量少,但体外培养6天后卵泡存活率更高。综合考虑,本实验选择采用显微分离方法分离生后15天小鼠腔前卵泡用做体外培养。3.通过建立一个适于小鼠腔前卵泡体外发育无血清培养系统,探索添加FSH、LH、VC对小鼠卵泡／卵母细胞体外生长发育的影响,旨在摸索一套适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的培养体系。结果表明：腔前卵泡随着体外培养时间的延长,卵泡越来越大,卵泡直径和其中的卵母细胞直径都增加,但是卵母细胞增长的没有卵泡增长的快。且各浓度组在培养的第4天时,卵泡及卵母细胞直径增长最快。且第4天与第2,6,8天的卵泡增长值存在显着性差异（P<0.05）。无血清基础培养液中联合添加FSH400+LH 200、VC50ug/ml能够较大程度的促进卵泡及其中的卵母细胞增长,提高卵泡的存活率及成腔率,第八天后添加hCG和EGF进行培养24h,发生的GVBD率和排出PB1率比对照组要高。4.运用DNA琼脂糖凝胶电泳技术和RT-PCR技术来分别检测上述所选的无血清培养系统培养的不同时间的腔前卵泡凋亡情况及其Bcl-2/Bax在mRNA层次的基因表达情况,从分子生物学方面对该无血清培养系统进行评价。结果表明：在卵泡培养的第0天和第2,第6天,无论基础培养液还是上述的联合添加的完全培养液,bax和bcl-2基因都有表达,且随着培养时间的延长其表达越来越强,但是在培养的初中期bax的表达与bcl-2相当。只是在第6天时,对照组中表达稍强些。从培养的效果来看,实验组与对照组在培养的同期相比,实验组的Bax、Bcl-2基因表达均比对照组要强。DNA琼脂糖凝胶电泳检测卵泡凋亡结果显示：不论对照组还是实验组,都没出现典型的细胞凋亡的特征。表明本实验采用的基础培养液中联合添加FSH400mIU/mL、LH200mIU/mL和VC50ug/ml后用于体外腔前卵泡的培养是可行的。5.本研究还对牛卵巢中腔前卵泡和有腔卵泡的分布和形态学特征进行了研究,同时对牛卵巢中的腔前卵泡进行了体外分离和体外成熟培养,结果表明：牛卵泡的分布具有明显的区域性,与小鼠卵巢中卵泡的分布一致。体外培养试验中得到了释放第一极体的成熟卵母细胞。
万旭英,张天宝[6]（2009）在《卵巢卵泡体外培养系统及其在生殖毒理学中的研究进展》文中研究指明
董书伟[7]（2007）在《小鼠和人胚胎生殖细胞的分离与无血清培养》文中研究说明胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells, EG cells）是来源于原始生殖细胞的具有多能性的干细胞,目前,小鼠和人胚胎生殖细胞的分离培养均取得了一些重大进展,但是,昆明小鼠的EG细胞系尚未建立,人EG细胞无血清培养体系尚未完善。因此,研究昆明小鼠和人EG细胞无血清培养体系,对于建立小鼠和人的EG细胞系及促进人EG细胞的临床应用,都具有十分重要的现实意义。为了完善昆明系小鼠和人EG细胞无血清培养体系,本试验进行了以下研究:1从消化酶浓度及消化时间,对昆明小鼠原始生殖细胞的分离培养进行研究;2探讨不同培养液对昆明小鼠原始生殖细胞体外培养的影响;3比较了MEF和不同来源的人胎儿成纤维细胞作为饲养层,培养人EG细胞的效果;4比较了不同传代方法对培养人EG细胞的影响,并对分离得到的人和小鼠的EG细胞进行了初步鉴定。1.昆明系小鼠胚胎生殖细胞的无血清培养在消化小鼠生殖嵴时,使用0.125%胰酶+0.02% EDTA在室温搅拌消化20min或37℃搅拌消化10min均可,效果显着优于使用0.25%胰酶+0.04% EDTA和0.05%胰酶+0.008% EDTA两种不同浓度的消化液;在无血清培养基中添加0.1mmol/L RA;使用条件培养基MEF-CM和GR-CM,均能得到较多的小鼠PGCs阳性集落。MEF-CM和GR-CM与细胞因子组（LIF和bFGF）相比,效果差异不显着,但降低了培养基的成本。使用GR-CM和细胞因子LIF和bFGF组合都将昆明系小鼠EG细胞传至第六代;从10.5～12.5dpc小鼠胎儿中可以分离培养出较多PGCs集落,并能得到较多的传代培养集落。对所得到的昆明小鼠EG细胞进行鉴定,AP染色和SSEA-1、Oct-4均呈阳性。2.人胚胎生殖细胞的无血清培养MEF和人胎儿生殖嵴源的hEF2比人胎儿皮肤源的hEF1更适合作为人EG细胞体外培养的饲养层细胞,能够得到较多的PGCs原代阳性集落数和较高的平均传代数;人EG细胞传代时,使用手工剥离后分割集落方法可以获得较高的集落形成率,并能培养较多的代数。手工剥离加消化和先消化饲养层再消化集落方法也获得了较好的效果,连同饲养层一起消化传代的效果最差;8～10周龄胎儿是最适合分离培养人EG细胞的。对所得到的人EG细胞进行鉴定,AP染色、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81、Oct-4均呈阳性。
王国华[8]（2007）在《山羊卵母细胞和孤雌激活胚胎体外无血清培养的研究》文中进行了进一步梳理本文为研究山羊卵母细胞和孤雌激活胚胎在无血清成熟液和培养液中的成熟、发育情况而做了两个实验:（1）山羊卵母细胞无血清体外成熟培养;（2）山羊孤雌激活胚胎无血清体外培养。实验的目的是为避免血清对卵母细胞和胚胎的副作用和不利影响而建立一种山羊胚胎的无血清体外培养体系。1.在OM成熟液中分别以0.3%牛血清蛋白（BSA）（m/v）、1%聚乙烯醇（PVA）（m/v）和1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠（ITS）（v/v）代替成熟培养液中胎牛血清（FBS）,以添加5%FBS的OM为对照组,对来源于屠宰场的卵丘卵母细胞复合体（COCs）进行体外培养。成熟率PVA添加组（50.00%）,极显着低于FBS组（83.23%）（P<0.01）,BSA组（71.19%）和ITS组（76.79%）与FBS组无显着差异（P>0.05）;成熟卵母细胞用离子霉素联合6-DMAP激活,在SoFaa中进行孤雌胚培养,BSA、PVA、ITS及FBS各组的卵裂率依次为61.90%、46.97%、79.07%和83.58%,囊胚率分别为25.00%、19.70%、55.81%和60.45%。结果表明:在OM基础培养液中添加BSA或PVA,卵母细胞的成熟率明显低于添加FBS,且卵裂率和囊胚发育率也低于对照组（P<0.05或P<0.01）;添加ITS,卵母细胞成熟率虽低于对照组,但孤雌胚卵裂率和囊胚发育率与对照组接近（P>0.05）。2.在SoFaa胚胎培养液中分别添加1% ITS（v/v）、0.6%BSA（m/v）和0.1% PVA（m/v）,以0.6%BSA（m/v）+10% FBS（v/v）为对照组,共分为四组对用离子霉素联合6-DMAP孤雌激活的卵母细胞进行体外培养。在加入ITS、BSA、PVA和BSA+FBS组的卵裂率分别为82.27%、75.10%、72.57%和80.29%;囊胚率分别为38.76%、13.81%、7.73%和56.82%。结果表明:在SoFaa中加入ITS组的山羊孤雌激活胚胎第一次卵裂率与加入BSA、PVA和BSA+FBS组的差异不显着（P>0.05）;而囊胚率虽然极显着高于BSA和PVA组（P<0.01）,但是也极显着低于加入BSA+FBS组（P<0.01）。结论:（1）在本实验条件下,在OM成熟液中添加ITS可以使卵母细胞很好的成熟,表明以ITS代替FBS,可用于山羊卵母细胞体外成熟培养。（2）在胚胎培养液SoFaa中添加ITS得到略高于其它组的卵裂率（P>0.05）,所以ITS可代替BSA+FBS用于胚胎第一次卵裂前后的培养;但是由于ITS不能达到FBS对胚胎发育至囊胚的营养支持其它方面的促进作用,所以不能完全代替培养液中血清使胚胎发育至囊胚,因此要想完全替代培养液中的血清可能需要ITS和一些物质联合使用,或寻找其它物质代替血清才能达到有血清存在时的胚胎发育效果。
华进联[9]（2005）在《人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究》文中认为原始生殖细胞（PGCs）是各级生殖细胞和成熟配子的共同祖先。在体外适宜的培养条件下,PGCs 大量增殖形成与ESCs 高度类似的多能性细胞,称作EG 细胞。目前,小鼠和其他哺乳动物及人类:EG 细胞的分离培养均取得一些重要的进展,但有关人类PGCs 发育分化、体外分离培养体系及影响因素、无血清培养及检测、人类EGCs 的诱导分化特性等尚未见到系统的研究报道,本研究对上述4 个方面展开研究,以期探索出人类胚胎性腺生殖细胞发育分化规律;建立优化的人类EGCs 无血清分离培养体系;检测人类EGCs 的多向分化潜能,并在人类:EGCs 分离培养的基础上,向hEGCs 转染人类心肌α-actin 启动子,以探索人类心肌α-actin 启动子在人类心肌细胞分化中的作用。1 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究组织学观察人胚胎睾丸和卵巢,Ki67 在10 w 胚胎睾丸表达最强,卵巢则在20 w 强表达。Bcl-2 在11.5 w 胚胎睾丸强表达,而在胚胎卵巢发育中一直表达较弱。在5～12 w 的睾丸,PGCs 强表达AKP、Oct4、SSEA-1;13 w 后,随胎龄增大,Oct4、AKP、SSEAl 表达减少。在5～32 w 的卵巢内,Oct4、AKP、SSEAl 在8 w 内的生殖细胞强表达;但在14 w 以后卵巢,Oct4、AKP、SSEAl 表达逐渐减少。透射电镜观察,早期胚胎的生殖嵴/腺见到大量的PGCs,一般为圆形或椭圆形,细胞核大,核质比高,细胞器较少。在出现性别分化后,雄性可见有间质细胞和支持细胞,细胞器较为丰富。雌性可见较大的卵母细胞和颗粒细胞。2 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立5%～15%NBS 均可以满足HEF、MEF 生长,以8%～10%NBS 为宜。对H=EF 的培养, 以}tDMEM 和α-MEM 效果较好。对MEF 的培养,HDMEM 效果最好。MEF、STO、HEF 等制作好的饲养层细胞维持时间不能超过7 d , 一般为5 ～7 d 。研究了流产胎儿对hEGCs 分离克隆的影响,表明7～12 w 最适于hEGCs 分离克隆, 自雄性胎儿分离hEGCs 的成功率明显高于雌性。筛选了几种细胞因子对hEGCs 生长增殖的最佳剂量,表明RA 和Forskolin 的最佳剂量分别为10-6mol/L 和10 u mol/L;LIF 为5 ng/mL:bFGF 为10 ng/mL;TNFa 为25 ng/mL;TGFB 的添加不利于hEGCs 克隆增殖;进一步将各种细胞因子组合能提高hPGCs 克隆增殖率,以此提出hEGCs 的最优培养基为:HDMEM+15%KSR+0.1 mmol/L 2Me +O.1 mmol/L 非必需氨基酸+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 u/mL 青霉素+100 u/mL 链霉素,
吕丽华[10]（2004）在《山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究》文中提出本文研究山羊卵母细胞体外培养、体外受精及胚胎体外培养程序的优化,目的是为建立一套完善的山羊胚胎体外生产体系。从而为该技术走出实验室,在实践中得以应用提供理论依据。同时探讨山羊胚胎干细胞的分离培养技术,为核移植、转基因等胚胎工程后技术的应用奠定基础。试验一研究山羊卵母细胞体外成熟的培养方法,以提高山羊卵母细胞的成熟率。使用微滴法培养,探讨山羊卵母细胞的回收、成熟液的调整对比、添加不同激素、以及不同抗氧化物质等对山羊卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,选用胞质均一致密,外围至少有3 层以上卵丘细胞包裹的A 级卵母细胞,添加浓度为1 μg/ml 的E 2、5 μM 的?-ME,成熟培养27h 可显着提高卵母细胞体外培养的成熟率。使用国产绒促激素完全可以代替进口的FSH 和LH 用于山羊卵母细胞体外成熟培养,在相同效果的前提下可大大降低成本。试验二研究山羊体外受精条件的优化,为提高体外成熟卵母细胞的受精质量和数量提供理论基础。比较体外受精方法,不同获能物质的影响表明不同精子获能中,肝素效果比较稳定。Percoll 法处理精子卵裂率要显着高于上浮法,但是囊胚率和囊胚细胞数并没有提高。上浮法的精子镜检活力要好于Percoll 法分离的精子。但是,总体受精率、发育率还很低。试验三通过优化培养程序,筛选培养液,以建立适合山羊胚胎体外发育的培养体系。通过共培养方法对共培养体系、换液程序、以及不同培养液的研究表明,在山羊胚胎培养中,基础培养液选用配制简单的SOF（CR1 也可使用）,添加BSA/FCS,并采用正确换液程序,即48h 前是SOF+BSA,之后换为SOF+FCS 可获得理想的囊胚率和卵裂率。共培养条件下颗粒细胞和输卵管细胞对胚胎的发育并没有明显差异,但就发育率而言,显着优于无共培养体系。由此,说明共培养细胞类型对胚胎发育影响不大,但可以很好地克服胚胎的816-细胞阻滞。试验四利用透射电镜研究山羊体内胚和体外胚的超微结构,旨在对体外胚胎质量及其培养体系进行评价,为进一步提高体外胚胎的质量提供超微结构方面的理论依据。结果表明山羊体外胚胎质量要比体内发育胚差,包含有大量脂滴、畸形线粒体以及空泡化严重、细胞间隙连接较少且松散、核质比下降等。试验五以体内受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚三种不同来源的囊胚为材料,分离山
二、小鼠胚胎卵巢体外无血清培养体系的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠胚胎卵巢体外无血清培养体系的建立（论文提纲范文）
（1）淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一、补肾中药调控干细胞的相关研究 |
| 1. 淫羊藿对干细胞的调控 |
| 2. 其他补肾中药对干细胞的调控 |
| 二、HGF在干细胞领域的研究进展 |
| 1. HGF的概述 |
| 2. HGF对干细胞的影响 |
| 三、线粒体自噬的研究进展 |
| 1. 线粒体自噬的概述 |
| 2. 中药调控线粒体自噬 |
| 第二部分 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路增强人脐带间充质干细胞抗凋亡能力的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验细胞 |
| 2. 实验仪器 |
| 3. 实验试剂与耗材 |
| 4. 主要试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. MTS法测细胞活力 |
| 3. CCK8法测细胞活力 |
| 4. BrdU掺入试验测细胞增殖率 |
| 5. 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 6. western blot(化学)方法检测蛋白表达 |
| 7. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 8. 质粒提取与细胞转染 |
| 9. ELISA法测蛋白表达 |
| 10. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 淫羊藿素促进人脐带间充质干细胞的细胞活力与增殖活性 |
| 2. HGF/c-Met通路在人脐带间充质干细胞中具有抗凋亡作用 |
| 3. 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路抑制人脐带间充质干细胞凋亡 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞线粒体自噬的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1. MTS法测细胞活力 |
| 2. western blot(荧光)方法检测蛋白表达 |
| 3. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 4. MitoTracker与目标蛋白共标记进行免疫荧光显微镜检测 |
| 5. 线粒体膜电位检测(JC-1) |
| 6. 电镜检测 |
| 7. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 自噬抑制剂3-MA对无血清培养人脐带间充质干细胞的影响 |
| 2. 淫羊藿素增加无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体蛋白 |
| 3. 淫羊藿素抑制无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体自噬 |
| 4. 淫羊藿素提高无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体膜电位 |
| 四、讨论 |
| 第四部分 淫羊藿素预处理人脐带间充质干细胞蛋白质组学分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 蛋白浓度测定结果 |
| 2. 差异蛋白筛选结果 |
| 3. 生物信息学分析 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）基于P（MVE-alt-MA）的凝胶用于卵巢癌干细胞样细胞富集的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 卵巢癌 |
| 1.1.1 卵巢癌转移 |
| 1.1.2 癌症起源 |
| 1.2 癌干细胞 |
| 1.2.1 CSCs特性及鉴定 |
| 1.2.2 CSCs标志物 |
| 1.2.3 肿瘤微环境 |
| 1.2.4 CSCs干性相关信号通路 |
| 1.2.5 耐药相关通路 |
| 1.3 CSCs的分离与富集 |
| 1.3.1 CSCs标志物法 |
| 1.3.2 无血清培养法 |
| 1.3.3 药物筛选法 |
| 1.3.4 细胞硬度检测法 |
| 1.4 构建微环境用于CSCs的分离与富集 |
| 1.4.1 生物材料模拟微环境 |
| 1.4.2 材料富集CSCs的可能机制 |
| 1.4.3 细胞外基质对干性的影响及CSCs的富集 |
| 1.4.4 合成材料对干性的维持及CSCs的富集 |
| 1.5 论文的选题和研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 PEG交联的P(MVE-alt-MA)凝胶的弹性模量对卵巢癌干细胞样细胞富集的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验部分 |
| 2.3.1 PEG交联的P(MVE-alt-MA)凝胶的制备与表征 |
| 2.3.2 细胞的接种与培养 |
| 2.3.3 细胞增殖及活性检测 |
| 2.3.4 CSCs相关标志物的检测 |
| 2.3.5 细胞耐药性检测 |
| 2.3.6 肿瘤侵袭、迁移、恶性转变等信号通路相关基因的检测 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 凝胶的内部形貌 |
| 2.4.2 凝胶的红外光谱分析 |
| 2.4.3 凝胶的流变学性能 |
| 2.4.4 凝胶的溶胀性 |
| 2.4.5 SK-OV-3 细胞在凝胶中三维生长成球状体 |
| 2.4.6 球状体细胞的增殖及活性表达 |
| 2.4.7 免疫荧光染色、Western Blot及PCR检测的球状体中CSCs相关标志物的表达与分析 |
| 2.4.8 球状体细胞的耐药性表达与分析 |
| 2.4.9 肿瘤侵袭、迁移、恶性转变等信号通路相关基因的表达与分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 PEG交联的P(MVE-alt-MA)凝胶中RGD含量对卵巢癌干细胞样细胞富集的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验部分 |
| 3.3.1 RGD修饰的PEG交联的P(MVE-alt-MA)凝胶的制备与表征 |
| 3.3.2 细胞的接种与培养 |
| 3.3.3 细胞增殖及活性检测 |
| 3.3.4 CSCs相关标志物PCR检测 |
| 3.3.5 琼脂糖凝胶培养的细胞中标志物的检测 |
| 3.3.6 细胞耐药性检测 |
| 3.3.7 肿瘤侵袭、迁移、恶性转变等信号通路相关基因的检测 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 凝胶的内部形貌 |
| 3.4.2 凝胶的氮元素分析 |
| 3.4.3 凝胶的力学性能 |
| 3.4.4 凝胶的溶胀性 |
| 3.4.5 SK-OV-3细胞在凝胶表面生长情况 |
| 3.4.6 细胞的增殖及活性表达 |
| 3.4.7 CSCs相关标志物的表达与分析 |
| 3.4.8 细胞的耐药性表达与分析 |
| 3.4.9 肿瘤侵袭、迁移、恶性转变等信号通路相关基因的表达与分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 PEG交联的P(MVE-alt-MA)和海藻酸盐双网络凝胶对卵巢癌干细胞样细胞富集的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验部分 |
| 4.3.1 PEG交联的P(MVE-alt-MA)和海藻酸盐双网络凝胶的制备与表征 |
| 4.3.2 细胞的接种与培养 |
| 4.3.3 细胞增殖及活性检测 |
| 4.3.4 CSCs相关标志物的检测 |
| 4.3.5 细胞耐药性检测 |
| 4.3.6 肿瘤侵袭、迁移、恶性转变等信号通路相关基因的检测 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 凝胶的内部形貌 |
| 4.4.2 凝胶的红外光谱分析 |
| 4.4.3 凝胶的流变学性能 |
| 4.4.4 凝胶的溶胀性 |
| 4.4.5 SK-OV-3细胞在凝胶中的三维生长成球状体 |
| 4.4.6 球状体细胞的增殖 |
| 4.4.7 凝胶中生长的球状体的活性表达 |
| 4.4.8 免疫荧光染色、Western Blot及PCR检测的球状体中CSCs相关标志物的表达与分析 |
| 4.4.9 球状体细胞的耐药性表达与分析 |
| 4.4.10 肿瘤侵袭、迁移、恶性转变等信号通路相关基因的表达与分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于P(MVE-alt-MA)的凝胶富集的卵巢癌干细胞样细胞的致瘤性评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.3 实验部分 |
| 5.3.1 NCG鼠皮下人卵巢癌肿瘤模型的建立 |
| 5.3.2 肿瘤分析 |
| 5.3.3 肿瘤组织病理检测 |
| 5.3.4 CSCs相关标志物的免疫组化检测 |
| 5.3.5 统计学分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 NCG鼠瘤体统计分析 |
| 5.4.2 组织病理学观察与分析 |
| 5.4.3 瘤体中CSCs相关标志物表达与分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 论文创新点 |
| 6.3 论文展望 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文及成果 |
（3）DA品系大鼠胚胎干细胞系的建立及多能性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.前言 |
| 1.1 哺乳动物多能性干细胞研究概况 |
| 1.1.1 胚胎干细胞 |
| 1.1.2 核移植胚胎干细胞 |
| 1.1.3 多能性诱导干细胞 |
| 1.2 大鼠胚胎干细胞研究进展 |
| 1.2.1 大鼠胚胎干细胞研究历史 |
| 1.2.2 大鼠及小鼠胚胎干细胞的多能信号通路 |
| 1.2.3 大鼠胚胎干细胞系的建立 |
| 1.2.4 大鼠胚胎干细胞与疾病动物模型 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和耗材 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 大鼠胚胎的获取与移植 |
| 2.2.2 大鼠胚胎干细胞系的建立 |
| 2.2.3 大鼠胚胎干细胞鉴定 |
| 2.2.4 大鼠胚胎干细胞嵌合体制作 |
| 2.2.5 大鼠胚胎干细胞核移植 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 大鼠囊胚的获取 |
| 3.1.1 不同超排方案获取大鼠受精卵 |
| 3.1.2 不同超排方案获取大鼠囊胚 |
| 3.2 大鼠胚胎干细胞系的建立 |
| 3.2.1 建立DA大鼠胚胎干细胞 |
| 3.2.2 DA大鼠胚胎干细胞系的鉴定 |
| 3.2.3 传代对大鼠胚胎干细胞的影响 |
| 3.2.4 大鼠胚胎干细胞体外分化能力鉴定 |
| 3.3 大鼠胚胎干细胞多能性鉴定 |
| 3.3.1 大鼠胚胎干细胞嵌合体制备 |
| 3.3.2 大鼠胚胎干细胞种系嵌合的鉴定 |
| 3.4 改良大鼠胚胎干细胞培养体系(N2B27-4i)的建立 |
| 3.4.1 N2B27-4i培养体系对大鼠胚胎干细胞增殖的影响 |
| 3.4.2 N2B27-4i培养体系大鼠胚胎干细胞种系嵌合能力的影响 |
| 3.5 胚胎干细胞核移植的方法获得大鼠模型 |
| 3.5.1 大鼠卵母细胞的孤雌激活 |
| 3.5.2 大鼠胚胎干细胞核移植及核移植胚胎干细胞(ntES)的建立 |
| 3.5.3 大鼠胚胎干细胞核移植胚胎体内发育 |
| 4.讨论 |
| 4.1 大鼠受精卵及囊胚的获取 |
| 4.2 大鼠胚胎干细胞分离与鉴定 |
| 4.3 大鼠胚胎干细胞种系嵌合 |
| 4.4 大鼠胚胎干细胞改良培养体系N2B27-4i |
| 4.5 大鼠胚胎干细胞核移植 |
| 4.6 展望 |
| 5.结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略语表 |
| 附录二 mR1ECM培养液配方 |
| 附录三 大鼠核移植相关溶液配制方法 |
| 攻读博士期间已发表的学术论文 |
（4）冻融人卵巢组织腔前卵泡的分离及体外培养的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 人卵巢组织腔前卵泡的分离及体外培养研究 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）小鼠和牛腔前卵泡体外分离培养的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.卵泡生长发育的一般规律和动态模式 |
| 2.动物腔前卵泡体外培养的研究概况 |
| 3 影响动物腔前卵泡体外分离效果的因素 |
| 3.1 动物的品种和年龄 |
| 3.2 卵巢大小、发育状况及处理时间 |
| 3.3 分离方法 |
| 4 影响动物腔前卵泡体外发育的因素 |
| 4.1 气相环境和温度 |
| 4.2 培养基和血清 |
| 4.3 培养时卵泡的大小和数量 |
| 4.4 培养体系 |
| 4.5 添加物 |
| 5.Bcl-2家族与卵泡的生长发育 |
| 6.存在的问题及其应用前景 |
| 7.本研究的意义及总体设计 |
| 第2章 小鼠卵巢不同发育时期腔前卵泡的分布及形态学研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源及处理 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂及其他实验用品 |
| 1.4 主要溶液的配置 |
| 1.5 材料处理及卵巢组织切片的制作 |
| 1.6 卵泡分类 |
| 1.7 试验设计及方法 |
| 1.8 测量标准 |
| 2 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 小鼠卵巢的一般形态结构 |
| 3.2 小鼠不同发育时期卵巢卵泡的分布 |
| 3.3 小鼠腔前卵泡直径、卵母细胞直径和颗粒细胞层厚度的测量 |
| 3.4 小鼠腔前卵泡在卵巢中的分布 |
| 4.分析和讨论 |
| 5.结论 |
| 第3章 小鼠腔前卵泡分离方法的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 主要溶液的配置 |
| 1.3 卵泡分离方法 |
| 1.4 小鼠腔前卵泡的评定标准及卵母质量判断 |
| 1.5 小鼠腔前卵泡存活力鉴定 |
| 1.6 试验设计 |
| 2 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 不同胶原酶浓度对小鼠腔前卵泡分离的影响 |
| 3.2 两种分离法分离小鼠腔前卵泡所得数量、质量及处理时间的比较 |
| 3.3 两种分离方法对卵泡存活率的影响 |
| 4.分析与讨论 |
| 5.结论 |
| 第4章 小鼠腔前卵泡的无血清体外培养研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂及仪器 |
| 1.2 腔前卵泡的分离 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 小鼠腔前卵泡无血清培养系统的建立 |
| 1.5 腔前卵泡的培养 |
| 1.6 腔前卵泡的测量 |
| 1.7 腔前卵泡发育过程中质量的评定标准 |
| 1.8 试验设计 |
| 2.统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 小鼠腔前卵泡体外培养形态结构的变化 |
| 3.2 基础培养液中添加不同浓度FSH对小鼠腔前卵泡及其卵母细胞体外生长的影响 |
| 3.3 基础培养液中添加不同浓度LH对小鼠腔前卵泡及其卵母细胞体外生长的影响 |
| 3.4 基础培养液中联合添加FSH、LH对小鼠腔前卵泡及其卵母细胞体外生长的影响 |
| 3.5 不同浓度的维生素C对小鼠腔前卵泡及其卵母细胞体外生长的影响 |
| 3.6 联合添加物对小鼠腔前卵泡及其卵母细胞体外生长的影响 |
| 4. 分析与讨论 |
| 4.1 小鼠腔前卵泡的体外生长 |
| 4.2 促性腺激素对小鼠腔前卵泡及其卵母细胞体外发育的影响 |
| 4.3 抗氧化剂对小鼠腔前卵泡及其卵母细胞体外发育的影响 |
| 5. 结论 |
| 第5章 小鼠腔前卵泡体外培养过程中Bcl-2/Bax基因表达的研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.所需的主要试剂及主要仪器 |
| 3.所需主要溶液的配置 |
| 4 试验设计 |
| 5 实验方法 |
| 5.1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测卵泡凋亡 |
| 5.2 RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2,bax的表达 |
| 6. 结果 |
| 6.1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测卵泡凋亡 |
| 6.2 RT-PCR检测卵泡凋亡相关基因bcl-2,bax的表达 |
| 7.分析与讨论 |
| 8.结论 |
| 第6章 牛腔前卵泡的分布、形态学及体外分离的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源及处理 |
| 1.2 腔前卵泡分类 |
| 1.3 腔前卵泡的体外分离方法 |
| 1.4 试验设计及方法 |
| 2.结果、分析与讨论 |
| 2.1 牛各级卵泡的形态学特征及分布特点 |
| 2.2 牛腔前卵泡的体外分离和体外成熟培养 |
| 小结 |
| 附图及附图说明 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（6）卵巢卵泡体外培养系统及其在生殖毒理学中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 卵巢卵泡体外培养概况 |
| 2 卵巢卵泡体外培养方法 |
| 2.1 卵巢器官培养 |
| 2.2 卵巢皮质薄片培养 |
| 2.3 腔前卵泡体外培养 |
| 2.3.1 腔前卵泡分离方法: |
| 2.3.2 腔前卵泡培养方法: |
| 2.3.3 不同直径腔前卵泡的培养: |
| 2.4 OGCs体外培养系统 |
| 2.5 COCs体外培养 |
| 3 在生殖毒理学中的应用 |
| 4 问题和展望 |
（7）小鼠和人胚胎生殖细胞的分离与无血清培养（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一章 小鼠和人胚胎生殖细胞的研究进展 |
| 1.1 小鼠和人胚胎生殖细胞的研究历程 |
| 1.1.1 小鼠胚胎生殖细胞的研究历程 |
| 1.1.2 人胚胎生殖细胞的研究历程 |
| 1.2 胚胎生殖细胞的分离培养及影响因素 |
| 1.2.1 胚胎生殖细胞的分离培养 |
| 1.2.2 EG 细胞分离培养的主要影响因素 |
| 1.3 EG 细胞的生物学鉴定 |
| 1.4 EG 细胞培养、建系中存在的问题及发展方向 |
| 1.4.1 EG 细胞不能完全替代ES 细胞 |
| 1.4.2 细胞数量及培养体系问题 |
| 1.5 从PGCs 分离培养EG 细胞的优势 |
| 第二章 PGCs、EG 和ES 细胞 |
| 2.1 PGCs 和EG 细胞 |
| 2.1.1 PGCs 在体内的发育与迁移分化 |
| 2.1.2 PGCs 本身不是多潜能干细胞 |
| 2.1.3 PGCs 在体外培养转化成EG 细胞 |
| 2.2 ES 细胞分化为PGCs |
| 2.2.1 ES 细胞体内分化为PGCs |
| 2.2.2 ES 细胞体外分化为PGCs |
| 2.3 EG 和ES 细胞 |
| 2.3.1 EG 细胞和PGCs 向ES 细胞的转化 |
| 2.3.2 EG 和ES 细胞的区别 |
| 实验研究 |
| 第三章 昆明系小鼠胚胎生殖细胞的无血清培养 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 不同培养液对小鼠EG 细胞体外培养的效果比较 |
| 3.3.2 不同消化分离方式对小鼠PGCs 原代培养的效果比较 |
| 3.3.3 胎龄对小鼠EG 分离培养的影响 |
| 第四章 人胚胎生殖细胞的无血清培养 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 人胎儿成纤维细胞的生长行为及形态学观察 |
| 4.2.2 人原始生殖细胞的生长行为及形态学观察 |
| 4.2.3 胎龄对人EG 细胞分离培养的影响 |
| 4.2.4 不同饲养层细胞对人EG 细胞传代培养的影响 |
| 4.2.5 不同传代方法对人EG 细胞传代培养的效果 |
| 4.2.6 人EG 细胞的生物学鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同传代方法对人EG 细胞传代培养的影响 |
| 4.3.2 胎龄对人EG 细胞分离培养的影响 |
| 4.3.3 不同饲养层细胞对人EG 细胞传代培养的影响 |
| 结论 |
| 进一步研究的内容 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）山羊卵母细胞和孤雌激活胚胎体外无血清培养的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究概况 |
| 1 哺乳动物卵母细胞的成熟过程及机理 |
| 1.1 哺乳动物卵母细胞成熟的基本过程 |
| 1.2 哺乳动物卵母细胞体外成熟机理的研究 |
| 1.2.1 成熟促进因子MPF |
| 1.2.2 环化核苷酸(cAMP)和蛋白激酶A(PKA) |
| 1.2.3 丝裂原活化蛋白酶(MAPK) |
| 1.2.4 次黄嘌呤 |
| 1.2.5 各类生长因子 |
| 1.2.6 钙离子Ca2+ |
| 1.2.7 成熟抑制因子(OMI) |
| 1.2.8 细胞生长抑制因子(CSF) |
| 1.2.9 卵母细胞与卵泡发育的关系 |
| 1.2.10 核质成熟及其关系 |
| 2 卵母细胞的采集方法 |
| 2.1 切剖法 |
| 2.2 抽吸法 |
| 2.3 切割法 |
| 2.4 剥离法 |
| 2.5 组织破碎法 |
| 3 卵母细胞体外培养成熟体系 |
| 3.1 含有血清改进的基础培养体系 |
| 3.1.1 血清 |
| 3.1.2 激素 |
| 3.1.3 卵泡液 |
| 3.1.4 生长因子 |
| 3.2 卵母细胞的无血清体外培养体系 |
| 3.2.1 BSA 的添加 |
| 3.2.2 PVA 的添加 |
| 3.2.3 ITS 的添加 |
| 4 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 4.1 动物的种类 |
| 4.2 动物的年龄和不同的生理阶段 |
| 4.3 卵母细胞的类型卵泡的大小 |
| 4.4 卵巢的运送时间和温度 |
| 4.5 培养成熟温度和时间 |
| 第二章 早期胚胎体外培养的研究进展 |
| 1 早期胚胎发育的研究进展 |
| 1.1 早期胚胎发育机理 |
| 1.2 胚胎的“发育阻断” |
| 1.3 胚胎“发育阻断”的克服 |
| 2 体外培养系统的研究概况 |
| 2.1 含有血清的培养系统 |
| 2.1.1 血清的添加 |
| 2.1.2 氨基酸的添加 |
| 2.1.3 碳水化合物的添加 |
| 2.1.4 牛磺酸和亚牛磺酸的添加 |
| 2.1.5 维生素的添加 |
| 2.2 体细胞共培养系统 |
| 2.2.1 输卵管上皮细胞共培养体系 |
| 2.2.2 颗粒/卵丘细胞单层共培养体系 |
| 2.2.3 子宫细胞共培养体系 |
| 2.2.4 成纤维细胞共培养体系 |
| 2.3 无血清培养系统 |
| 2.3.1 BSA 的添加 |
| 2.3.2 PVA 的添加 |
| 2.3.3 柠檬酸和肌醇的添加 |
| 2.3.4 ITS 的添加 |
| 2.3.5 Utroser G 和 Utroser HY 的添加 |
| 试验部分 |
| 第三章 山羊卵母细胞无血清体外成熟培养研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 卵巢卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte complexes，COCs）的回收 |
| 1.2 卵母细胞成熟培养液配制 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 1.4 成熟卵母细胞孤雌激活 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 OM 液中不同添加物对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.2 OM 液中不同添加物对孤雌激活胚早期发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 山羊孤雌激活胚胎无血清体外培养 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 卵丘卵母细胞复合体(COCs)的回收 |
| 1.2 卵母细胞成熟培养液配制 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 1.3 成熟卵母细胞的激活 |
| 1.4 胚胎培养所用培养液的配制 |
| 1.5 孤雌激活胚胎的培养 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 文献综述 |
| 第一章 原始生殖细胞发育与分化 |
| 1 原始生殖细胞的起源 |
| 1.1 小鼠原始生殖细胞的起源 |
| 1.2 影响小鼠原始生殖细胞起源的因素 |
| 1.3 人类原始生殖细胞的起源 |
| 2 原始生殖细胞的发生 |
| 2.1小鼠原始生殖细胞的发生 |
| 2.2人类原始生殖细胞的发生 |
| 3 PGCs发生和发育的有关基因及分子特征 |
| 3 1 frigilis和stella |
| 3.2 Oct-4基因 |
| 3.3 Nanog |
| 3.4.其它相关基因 |
| 4 PGCs的迁移 |
| 4.1 PGCs的迁移路径 |
| 4.2影响PGCs迁移的因素 |
| 5 原始生殖细胞与性别分化 |
| 6 生殖细胞的基因修饰 |
| 第二章 PGCs源的哺乳动物EG细胞研究进展 |
| 1 哺乳动物胚胎生殖细胞研究简史 |
| 2 胚胎生殖细胞的分离培养及影响因素 |
| 2.1 PGCs分离纯化和胚胎生殖细胞分离培养 |
| 2.2 影响胚胎生殖细胞分离培养的因素 |
| 3 胚胎生殖细胞的检测 |
| 3.1 形态学鉴定 |
| 3.2 细胞表面标志物 |
| 3.3 核型分析 |
| 3.4 EGN胞端粒酶活性 |
| 3.5 EGN胞的高度分化潜能 |
| 4 自PGCs分离克隆各种哺乳动物EGN胞的研究进展 |
| 4.1 小鼠 |
| 4.2 大鼠 |
| 4.3 兔 |
| 4.4 猪 |
| 4.5 羊 |
| 4.6 牛 |
| 4.7 人 |
| 5 影响PGCs与EG细胞生长增殖的机理 |
| 5.1 干细胞因子 |
| 5.2 bFGF和FGF受体 |
| 5.3 IL/LIF家族细胞因子 |
| 6 关于哺乳动物PGCs源EG细胞分离克隆的几个问题探讨 |
| 6.1 PGCs转化成EG细胞 |
| 6.2 EG细胞不能完全替代ES细胞 |
| 6.3 EG细胞分离克隆和诱导分化特性 |
| 第三章 人类胚胎干细胞的研究进展 |
| 1 人类胚胎干细胞的来源与培养方法 |
| 1.1 囊胚法(正常体内受精胚胎和体外受精胚胎) |
| 1.2 克隆胚胎法 |
| 1.3 孤雌激活胚胎法 |
| 1.4 其他途径来源的hES细胞的分离培养 |
| 2 建立和维持hESCs系的条件 |
| 2.1 饲养层 |
| 2.2 培养基组成 |
| 3 hES细胞的生物学特性及鉴定方法 |
| 4 hES细胞的储藏 |
| 4.1 ES细胞的冷冻与解冻 |
| 4.2 hES细胞登记储存 |
| 5 人类胚胎干细胞研究进展 |
| 5.1 由早期胚胎分离克隆hES细胞 |
| 5.2 由克隆胚胎分离克隆ES细胞研究 |
| 5.3 hES细胞的遗传操作 |
| 5.4 hES细胞定向分化的研究 |
| 6 人类胚胎干细胞研究存在的问题及急需解决的问题 |
| 6.1 伦理道德之争 |
| 6.2 无饲养层和无血清培养体系高效快速大规模扩增hESCs体系的建立 |
| 6.3 ES细胞向特定类型重要功能细胞分化的技术 |
| 6.4 ES细胞源特定分化细胞的扩增与筛选纯化 |
| 6.5 ES细胞源细胞移植治疗的免疫排斥问题 |
| 6.6 ES细胞源细胞移植治疗的安全性问题 |
| 7 人类胚胎干细胞研究的趋势与前景 |
| 8 世界上一些已建系的实验室对人类ES细胞的管理规则 |
| 第四章 ES细胞体外定向诱导分化 |
| 1 胚胎干细胞增殖与分化的信号调节机制 |
| 1.1 STAT3 信号通路对胚胎干细胞增殖及分化的调节 |
| 1.2 ERK信号通路对胚胎干细胞增殖及分化的调节 |
| 1.3 Nanog对ES细胞多能性的维持 |
| 2 ES细胞体外诱导分化 |
| 2.1 ES细胞体外诱导分化的意义 |
| 2.2 ES细胞体外诱导分化的基本原理 |
| 2.3 ES细胞体外定向诱导分化方法 |
| 2.4 诱导分化程序 |
| 2.5 ES细胞体外诱导分化细胞类型 |
| 3 胚胎干细胞诱导分化研究展望 |
| 第五章 ES、EG细胞与生殖细胞 |
| 1 生殖细胞的发生和细胞标记 |
| 1.1 生殖细胞的发生 |
| 1.2 生殖细胞的特异性标记 |
| 2 ES、EG细胞与生殖细胞的关系 |
| 2.1 ES、EG细胞与生殖细胞的相似性 |
| 2.2 ES、EG细胞向生殖细胞分化 |
| 2.3 ES、EG细胞与生殖细胞的区别 |
| 结语 |
| 试验研究 |
| 第六章 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 人胚胎生殖嵴/性腺的形态与定位 |
| 2.2 HE染色观察结果 |
| 2.3 PAS染色观察结果 |
| 2.4 免疫组织化学染色观察结果 |
| 2.5 人胚胎性腺生殖细胞的AKP染色 |
| 2.6 人胚胎性腺生殖细胞的超微结构 |
| 3 讨论 |
| 3.1 人胚胎睾丸生殖细胞的发育分化 |
| 3.2 人胚胎卵巢生殖细胞的发育分化 |
| 4 小结 |
| 第七章 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各种饲养层细胞的分离培养与生长 |
| 2.2 培养液对各种饲养层细胞生长的影响 |
| 2.3 流产胎儿对PGCs分离克隆的影响 |
| 2.4 消化液和消化时间及PERCOLL密度梯度纯化对流产儿PGCs分离克隆的影响 |
| 2.5 细胞外基质对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响 |
| 2.6 培养液及添加物对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响 |
| 2.7 饲养层 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胎儿对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响 |
| 3.2 消化液和消化时间及PERCOLL密度梯度纯化对PGCs分离克隆的影响 |
| 3.3 细胞外基质与人类胚胎生殖细胞分离克隆 |
| 3.4 细胞因子对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响 |
| 3.5 条件培养液与人类胚胎生殖细胞分离克隆 |
| 3.6 饲养层细胞类型对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响 |
| 4 小结 |
| 第八章 人类EG细胞的无血清培养及检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 人类EG细胞的无血清分离培养 |
| 2.2 人类EG细胞的检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 人类EG细胞的无血清分离培养 |
| 3.2 人类EG细胞的生物学特性及检测 |
| 4 小结 |
| 第九章 人类EG细胞体外定向诱导分化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 人类胚胎生殖细胞的分离培养和表面标记 |
| 2.2 人类EG细胞体外向心肌细胞诱导分化及检测 |
| 2.3 人类EG细胞体外向神经细胞分化及检测 |
| 2.4 人类EG细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化及检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 人类EG细胞向心肌细胞诱导分化 |
| 3.2 人类EG细胞向神经细胞诱导分化 |
| 3.3 人类EG细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化及检测 |
| 4 小结 |
| 第十章 人类胚胎生殖细胞转染心肌Α-ACTIN的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 hEGCs的转染、筛选与增殖 |
| 2.3 免疫组化检测 |
| 2.4 转染α-actin 的hEGCs向心肌细胞的诱导分化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 hEGCs的转染、筛选与增殖 |
| 3.2 α-actin在hEGCs中的表达 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 卵母细胞体外成熟的研究进展 |
| 1 哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究概况 |
| 2 哺乳动物卵母细胞发生、发育和成熟规律及调控机理 |
| 2.1 哺乳动物卵泡卵母细胞的发生 |
| 2.2 哺乳动物卵泡卵母细胞发育及成熟的一般过程 |
| 2.2.1 减数分裂启动及核网阻滞期 |
| 2.2.2 卵母细胞生长期 |
| 2.2.3 减数分裂恢复期 |
| 2.2.4 卵母细胞在MЦ期的停滞 |
| 2.3 哺乳动物卵母细胞体外成熟培养超微结构变化 |
| 2.4 哺乳动物卵母细胞生长和成熟过程的分子调控机理 |
| 2.4.1 成熟分裂阻滞 |
| 2.4.2 卵母细胞生长的调控 |
| 2.4.3 成熟分裂恢复 |
| 3 卵母细胞体外成熟培养的影响因素 |
| 3.1 成熟培养液对卵母细胞的影响 |
| 3.2 激素对卵母细胞体外成熟培养的影响 |
| 3.3 生长激素和生长因子的作用 |
| 3.4 卵泡液和颗粒细胞对卵母细胞体外成熟培养的影响 |
| 3.5 卵泡大小和卵丘细胞对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.6 其他添加物对卵母细胞体外成熟培养的影响 |
| 3.7 延迟成熟培养 |
| 3.8 其它条件对卵母细胞成熟的影响 |
| 第二节 哺乳动物体外受精和早期胚胎体外培养的研究进展 |
| 1 精子获能 |
| 1.1 精子获能的概念及特点 |
| 1.2 精子获能后的变化 |
| 1.3 影响精子获能的因素 |
| 1.3.1 环境因素 |
| 1.3.2 获能液和获能方法 |
| 1.3.3 影响精子获能的物质 |
| 2 体外受精 |
| 2.1 体外受精过程 |
| 2.2 影响体外受精的因素 |
| 3 胚胎培养体系 |
| 3.1 体内胚胎和体外胚胎发育的对比 |
| 3.2 胞质的不完全成熟是胚胎早期发育阻滞的主要原因 |
| 3.3 能量物质和蛋白质等有机物对胚胎发育的影响 |
| 3.3.1 能量物质对胚胎发育的影响 |
| 3.3.2 蛋白质及生长因子对胚胎发育的影响 |
| 3.3.3 氨基酸及粘多糖对胚胎发育的影响 |
| 3.4 抗氧化作用 |
| 3.5 培养液及共培养体系对胚胎发育的影响 |
| 3.5.1 培养液对胚胎发育的影响 |
| 3.5.2 共培养体系对胚胎发育的影响 |
| 3.6 物理因素对胚胎发育的影响 |
| 3.6.1 氧气浓度和无机离子及渗透压对胚胎发育的影响 |
| 3.6.2 其它方面的影响 |
| 第三节 哺乳动物胚胎干细胞的研究进展及应用前景 |
| 1 胚胎干细胞的生物学特性 |
| 2 各种动物ES 细胞的研究进展 |
| 2.1 小鼠ES 细胞的研究进展 |
| 2.2 仓鼠ES 细胞的研究进展 |
| 2.3 牛ES 细胞的研究进展 |
| 2.4 猪ES 细胞的研究进展 |
| 2.5 羊鼠ES 细胞的研究进展 |
| 2.6 兔ES 细胞的研究进展 |
| 2.7 猴ES 细胞的研究进展 |
| 3 胚胎干细胞的建系方法 |
| 3.1 早期胚胎来源及适宜分离培养的时间 |
| 3.2 胚胎干细胞分离培养方法 |
| 3.2.1 全胚胎培养法 |
| 3.2.2 ICM 培养法 |
| 3.2.3 克隆法 |
| 3.3 胚胎干细胞鉴定方法 |
| 3.3.1 形态学鉴定 |
| 3.3.2 免疫学鉴定 |
| 3.3.3 核型分析 |
| 3.3.4 体内分化试验 |
| 3.3.5 体外分化试验 |
| 3.3.6 嵌合体实验 |
| 3.4 胚胎干细胞的冻存及解冻 |
| 4 胚胎干细胞的应用前景 |
| 4.1 生产克隆动物 |
| 4.2 ES 细胞是基因修饰的高效载体 |
| 4.3 生产用于人类器官移植的动物器官 |
| 4.4 建立人类遗传病研究的动物模型 |
| 4.5 研究胚胎发育的基因调控 |
| 第二章 山羊卵母细胞体外成熟培养 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 液体 |
| 1.1.1 操作液 |
| 1.1.2 成熟培养液 |
| 1.2 山羊卵丘–卵母细胞复合体的收集与培养 |
| 1.3 COC 复合体的分级 |
| 1.4 卵母细胞成熟的判定 |
| 1.5 受精处理及胚胎培养 |
| 1.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同分级卵母细胞的成熟比较 |
| 2.2 不同成熟时间对山羊卵母细胞成熟的影响 |
| 2.3 成熟液中添加不同浓度雌激素对山羊卵母细胞成熟的影响 |
| 2.4 HT 和β–ME 对卵母细胞成熟的影响 |
| 2.5 不同成熟激素对山羊卵母细胞成熟的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同分级卵母细胞的成熟分析 |
| 3.2 不同成熟时间对山羊卵母细胞成熟的影响 |
| 3.3 成熟液中添加不同浓度雌激素对山羊卵母细胞成熟的影响 |
| 3.4 HT 和β–ME 对卵母细胞成熟的影响 |
| 3.5 不同成熟激素对山羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4 结论 |
| 第三章 山羊卵母细胞体外受精方法的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵母细胞采集和成熟 |
| 1.2 体外受精 |
| 1.2.1 受精液 |
| 1.2.2 精子的准备 |
| 1.2.3 精子获能 |
| 1.2.4 体外受精 |
| 1.2.5 受精率的观察 |
| 1.2.6 胚胎培养 |
| 1.2.7 胚胎细胞计数 |
| 1.2.8 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 肝素、咖啡因和钙离子载体对受精和胚胎发育的影响 |
| 2.2 精子的不同处理方法对卵裂率和囊胚率的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肝素、咖啡因和钙离子载体对对山羊精子获能、受精和胚胎发育的影响 |
| 3.2 精子的不同处理方法对卵裂率和囊胚率的影响 |
| 4 结论 |
| 第四章 山羊胚胎体外培养 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 山羊卵母细胞体外成熟和受精 |
| 1.2 胚胎培养 |
| 1.2.1 颗粒细胞制备 |
| 1.2.2 输卵管上皮制备 |
| 1.3 胚胎培养 |
| 1.4 囊胚细胞计数 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同共培养系统对受精后胚胎发育的影响 |
| 2.2 胚胎培养液中添加BSA、FCS 和不同换液程序对胚胎发育的影响 |
| 2.3 不同培养液在共培养系统的支持下对胚胎发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同共培养系统对受精后胚胎发育的影响 |
| 3.2 培养液中添加BSA、FCS 和不同换液程序对胚胎发育的影响 |
| 3.3 不同培养液在共培养系统的支持下对胚胎发育的影响 |
| 4 结论 |
| 第五章 山羊体外胚胎和体内胚胎的超微结构比较 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 体内胚胎的生产 |
| 1.2 体外胚胎的生产 |
| 1.2.1 卵母细胞成熟 |
| 1.2.2 精子体外获能和受精 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.3.1 受精卵分组 |
| 1.3.2 观察内容 |
| 1.4 电镜切片制备 |
| 1.4.1 电镜切片制作 |
| 1.4.2 线粒体的观察 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第六章 山羊胚胎干细胞的分离培养 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 主要溶液配制 |
| 2.1.1 无钙、镁DPBS 缓冲液的配制 |
| 2.1.2 消化液的配制 |
| 2.1.3 1mol/Lβ—巯基乙酸的配制 |
| 2.1.4 DMEM 培养液的配制 |
| 2.1.5 丝裂素—C 溶液的配制 |
| 2.1.6 0.196明胶溶液的配制 |
| 2.1.7 LIF 的分装 |
| 2.1.8 AKP 染色液的配制 |
| 2.2 山羊ES 细胞培养液 |
| 2.3 小鼠及山羊胎儿成纤维细胞饲养层的制备 |
| 2.3.1 小鼠胎儿成纤维(MEF)的分离与培养 |
| 2.3.2 山羊胎儿成纤维(GEF)的分离与培养 |
| 2.3.3 MET 和GEF 的继代培养 |
| 2.3.4 MET 和GEF 饲养层的制备 |
| 2.4 胚胎的制备 |
| 2.4.1 体内受精囊胚 |
| 2.4.2 体外受精囊胚 |
| 2.4.3 孤雌激活胚 |
| 2.5 山羊ES 细胞的分离与培养 |
| 2.5.1 ICM 的初次代代培养 |
| 2.5.2 山羊ES 细胞的继代培养 |
| 2.6 ES 细胞的鉴定 |
| 2.6.1 形态学鉴定 |
| 2.6.2 AKP 染色 |
| 2.6.3 核型分析 |
| 2.6.4 体外分化 |
| 3 结果 |
| 3.1 山羊ICM 的生长行为 |
| 3.2 不同来源的胚胎对山羊ES 细胞分离培养的影响 |
| 3.3 不同饲养层对山羊ES 细胞分离培养的影响 |
| 3.4 不同种类血清对山羊ES 细胞分离培养的影响 |
| 3.5 不同培养液对山羊ES 细胞分离培养的影响 |
| 3.6 山羊ES 细胞的鉴定 |
| 3.6.1 形态学鉴定 |
| 3.6.2 AKP 染色 |
| 3.6.3 核型分析 |
| 3.6.4 体外分化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胚胎来源及质量对山羊ES 细胞分离培养的影响 |
| 4.2 饲养层对山羊ES 细胞分离培养的影响 |
| 4.3 血清对山羊ES 细胞分离培养的影响 |
| 4.4 细胞因子对山羊ES 细胞分离培养的影响 |
| 4.5 山羊ES 细胞的鉴定 |
| 5 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
四、小鼠胚胎卵巢体外无血清培养体系的建立（论文参考文献）
- [1]淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究[D]. 王璐. 广州中医药大学, 2019(08)
- [2]基于P（MVE-alt-MA）的凝胶用于卵巢癌干细胞样细胞富集的研究[D]. 周乃珍. 东南大学, 2019(02)
- [3]DA品系大鼠胚胎干细胞系的建立及多能性检测[D]. 李天达. 东北农业大学, 2012(02)
- [4]冻融人卵巢组织腔前卵泡的分离及体外培养的研究[D]. 马莉. 郑州大学, 2011(04)
- [5]小鼠和牛腔前卵泡体外分离培养的研究[D]. 张耀君. 陕西师范大学, 2010(03)
- [6]卵巢卵泡体外培养系统及其在生殖毒理学中的研究进展[J]. 万旭英,张天宝. 毒理学杂志, 2009(06)
- [7]小鼠和人胚胎生殖细胞的分离与无血清培养[D]. 董书伟. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [8]山羊卵母细胞和孤雌激活胚胎体外无血清培养的研究[D]. 王国华. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [9]人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究[D]. 华进联. 西北农林科技大学, 2005(03)
- [10]山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究[D]. 吕丽华. 山西农业大学, 2004(06)