磷酸化Cep85的激酶鉴定

论文摘要

在真核生物细胞中,中心体是主要的微管组织中心,调控微管成核和纺锤体的形成,保证细胞分裂过程中染色体的准确分离。在分裂间期中心体间通过大量连接蛋白关联形成一个完整的微管组织中心。在有丝分裂起始阶段连接蛋白被有丝分裂激酶Nek2A磷酸化而消散,这将促使中心体分离,为随后双极纺锤体的形成创造条件。因此,Nek2A活性的实时调控对于有丝分裂的正常进行至关重要。Nek2A在分裂间期受到诸多蛋白的拮抗调控,研究表明中心体蛋白Cep85与Nek2A共定位于中心体上,在分裂间期能够结合并且抑制Nek2A活性,防止中心体在分裂间期过早分离。因此,Cep85是Nek2A活性的重要调控蛋白之一,帮助维持了分裂间期的中心体完整。但是,在G2晚期Cep85是如何解除对Nek2A的抑制作用保证中心体准时分离的机制却不清楚,本研究据此展开探讨。本实验室的早期研究发现Cep85结合Nek2A并抑制其活性,且Nek2A与Cep85共转能够导致其磷酸化,但Cep85却不是Nek2A的底物。蛋白磷酸化修饰可以改变蛋白质的活性、蛋白间相互作用以及胞内定位等,因此探究Cep85磷酸化的调控机制可能是阐释在细胞分裂的早期Nek2A如何能够摆脱Cep85的抑制,提高激酶活性的机制的基础。我们决定先鉴定出Cep85磷酸化的具体激酶。我们在Cdkl-Aurora A-Plkl-Mst2-Nek2A有丝分裂激酶信号调控通路中发现:Plk1与Cep85共转也能引发其磷酸化且二者存在明显相互作用,而且利用[γ-32P]ATP进行体外磷酸化实验证实是Plk1将Cep85磷酸化。除此之外,我们还通过模拟激酶活性状态、特异性磷酸化抗体检测、细胞内源蛋白敲低等实验从不同层面确认无论体内体外Plk1就是磷酸化Cep85的激酶,另外还发现Plk1只有在Nek2A率先结合Cep85的情况下才能够磷酸化Cep85,且Cep85磷酸化后存在Nek2A结合变弱的现象。因此本研究不仅鉴定出Plk1是磷酸化Cep85的激酶,而且还将Plk1、Cep85、Nek2A三者关联起来,为Cep85适时解除对Nek2A抑制的机制研究提供了方向,而且Cep85特异性磷酸化抗体的成功制备也为磷酸化Cep85相关功能的研究垫定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 中心体
•     1.1.1 中心体结构与功能
•     1.1.2 中心体周期与细胞周期
•     1.1.3 中心体与疾病
•   1.2 中心体分离调控
•     1.2.1 有丝分裂激酶信号通路调控
•     1.2.2 Cdk1与中心体分离
•     1.2.3 AuroraA与中心体分离
•     1.2.4 Plk1与中心体分离
•     1.2.5 Mst2与中心体分离
•     1.2.6 Nek2A与中心体分离
•   1.3 中心体蛋白Cep85
•   1.4 本文研究内容及意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 仪器与药品试剂等材料
•     2.1.1 主要仪器
•     2.1.2 主要药品试剂
•   2.2 分子克隆相关实验方法
•     2.2.1 PCR和目的基因表达质粒构建
•     2.2.2 定点突变PCR
•     2.2.3 shRNA质粒构建
•     2.2.4 超级感受态细胞制备
•     2.2.5 分子克隆相关实验主要试剂配制
•   2.3 细胞相关实验方法
•     2.3.1 细胞培养
•     2.3.2 HeLa细胞同步化
•     2.3.3 细胞转染
•     2.3.4 细胞感染敲低
•     2.3.5 细胞免疫荧光染色
•     2.3.6 细胞相关实验主要试剂配制
•   2.4 蛋白质相关实验方法
•     2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹
•     2.4.2 免疫共沉淀
•     2.4.3 GST-Cep85蛋白纯化
•     2.4.4 Cep85质谱分析蛋白样品制备
•     2.4.5 Cep85体外磷酸化
•     2.4.6 蛋白质相关实验主要试剂配制
• 第三章 结果与分析
•   3.1 Cep85与Plk1存在相互作用
•     3.1.1 Cep85与激酶共转和相互作用情况
•     3.1.2 Cep85与Plk1的相互作用
•     3.1.3 Cep85与Plk1在中心体上呈细胞周期依赖性的共定位
•   3.2 Cep85磷酸化的激酶鉴定
•     3.2.1 Plk1活性对Cep85磷酸化的影响
•     3.2.2 Plk1活性和Nek2A活性分别对由二者导致的Cep85磷酸化的影响
•     3.2.3 Plk1是Cep85磷酸化的真正激酶
•   3.3 细胞内源Cep85磷酸化的检测验证
•     3.3.1 Cep85特异性磷酸化抗体的制备与验证
•     3.3.2 磷酸化Cep85在细胞周期中的状况
•     3.3.3 BI2536抑制剂和Plk1敲低处理对Cep85磷酸化的影响
•   3.4 Cep85被Plk1磷酸化需要Nek2A的结合
•     3.4.1 内源Nek2A的敲低对Cep85磷酸化影响
•     3.4.2 Nek2A的结合导致Cep85被Plk1磷酸化
•     3.4.3 Plk1磷酸化Cep85不依赖Nek2A的活性
• 第四章 讨论
•   4.1 本研究总结
•   4.2 本研究展望
• 参考文献
• 硕士期间发表论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐镇平

导师: 余娴文

关键词: 磷酸化

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q253

总页数: 94

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