调控柑橘精油生物合成关键基因的挖掘

论文摘要

植物精油是食品、饮料、日化和药品等产业的重要原料,有很高的经济价值。柑橘精油约占世界植物精油产量的30%,是最主要的植物精油来源。柑橘精油储藏在位于果皮、花瓣、叶片等组织的油胞中,其中果皮中的精油含量最高,能达到鲜重的2%以上。果皮约占柑橘果实重量的20%,柑橘精油主要在榨汁过程中从果皮提取。提高果皮中精油的含量,将显著提高柑橘加工的附加值。不同柑橘品种果皮精油含量不同,这种差异通常由遗传因素造成,但其分子机制鲜有研究。本研究从金柑果皮油胞发育入手,结合精油成分分析,研究组织中精油积累和油胞发育的规律,以及精油成分的变化特征。并利用精油含量正常的金柑品种融安金柑与其实生变异、低精油含量品种滑皮金柑遗传背景相似这一特点,针对精油合成的遗传差异进行设计,对两个品种的果皮和叶片进行RNA-seq,分析与精油合成相关基因的表达特征,并筛选与精油合成密切相关的调控基因。通过对该调控基因进行生物信息学分析,预测其功能,并通过研究不同组织、不同品种中基因的表达水平与精油含量,分析其表达水平与精油含量的相关性。利用超表达、干扰、基因编辑等转基因技术,实现提高、降低候选基因的表达水平以及敲除掉该基因,分析转基因植株叶片中精油的成分及含量,阐明该基因在调控柑橘精油合成中的作用。主要研究结果如下:1.金柑的油胞形成于组织发育的早期,油胞分泌腔体积受精油积累量的影响。金柑果皮的油胞在组织发育的早期即已形成,在果实的生长过程中,因精油积累量的增加,油胞分泌腔的平均体积逐渐增大,但也有部分油胞分泌腔停止生长,大小油胞间的差异非常明显。随着果实从生长期进入成熟期,油胞分泌腔的体积增加更快,全部油胞分泌腔的体积同时增大的趋势更明显。精油在油胞分泌腔中的积累过程与果实发育过程并不同步。在生长阶段,果实生长速率和表面积增长速度明显快于成熟阶段,而果实成熟期的精油积累速度快于生长期。2.金柑果实在不同的生长发育时期果皮中挥发性成分的比例不同。抗菌性成分在果实成熟期比例明显降低。芳樟醇、α-萜品醇、香叶醇等具有良好抗菌能力的醇类化合物的含量在从花后30天时的3.99%降到果实成熟时的0.95%,其它具有较强抗菌能力的柠檬醛、香芹酮和樟脑等在果实成熟阶段其含量明显下降甚至未能检出。一些在其它柑橘品种果皮中常见的具有刺激性气味的成分,如莰烯（樟脑味）、α-水芹烯（松节油味）、石竹烯（辛辣味）和α-没药醇（辛辣味）等在金柑果实的成熟阶段未检出。樟脑和4-乙酰-1-甲基环己烯（辛辣味）仅在花后60天前的果皮中微量存在。这可能是金柑果皮刺激性小、适口性好、可以直接食用的原因之一。3.果皮精油含量的增加是单萜和倍半萜积累量增加的结果随着果实的发育,果皮精油成分中单萜的含量由5272.03μg·g-1（76.86%）增加到13587.04μg·g-1（80.49%）,倍半萜含量由976.07μg·g-1（14.07%）增加到2293.44μg·g-1（14.15%）,分别增加了1.58和1.35倍。而占总精油含量极低的非萜类化合物的含量由168.58μg·g-1（2.54%）增加到213.42μg·g-1（1.19%）,仅增加了0.27倍,但其比例明显降低。因此,金柑果皮中精油含量的增加,油胞分泌腔的膨大是单萜和倍半萜不断积累的结果。4.调控精油合成的重要候选基因筛选滑皮金柑（HP）的油胞数目和精油含量远低于融安金柑（RA）及其它柑橘品种。RNA-seq找到398个在果皮和叶片中有表达差异的基因,涉及到精油合成相关的代谢途径有萜类骨架生物合成（Terpenoid backbone biosynthesis,ko00900）、柠檬烯和蒎烯的降解（Limonene and pinene degradation,ko00941）、单萜的生物合成（Monoterpenoid biosynthesis,ko00902）和倍半萜和三萜的生物合成（Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis,ko00909）。对萜类骨架生物合成中的MEP途径和MVA途径的关键基因以及一些有代表性的单萜、单萜醇、倍半萜合成基因进行q RT-PCR分析。结果除了一个GGPPS外,其它MEP途径和MVA途径基因在叶片和果皮中的趋势并不一致。但多个萜烯合成酶基因在HP组织中表达水平显著下调,推测这些单萜和倍半萜合成酶基因共有的转录调控基因在HP中的表达水平可能发生了改变。进一步筛选,在叶片和果皮中的共有的398个DEG中找到4个可能与次生代谢调控相关的转录调控因子基因Cs2g14570、Cs5g01450、Cs7g08960和Cs4g03550。对这4个转录调控因子进行q RT-PCR分析。其中Cs2g14570（AP2/ERF转录调控因子）、Cs5g01450（MYC2转录调控因子）和Cs7g08960（F-box蛋白）在HP的叶片和果皮中的表达都较RA极显著下调。且前人研究证实,这三个类型的转录调控因子参与了次生代谢产物的调控。特别是MYC2基因,参与多个物种的倍半萜、双萜和生物碱合成的调控。因此,筛选Cs5g01450（暂命名为Fc MYC2）进行下一步的表达分析和转基因功能验证,以阐明其在柑橘精油合成调控中的作用。5.柑橘的Fc MYC2是一个序列特异性极高的MYC2型b HLH家族基因分别从HP和RA中成功地克隆了Fc MYC2,基因全长1563 bp,GC含量46%,编码520个氨基酸,其蛋白分子量58.35 KD,等电点6.83。该基因在甜橙基因Cs5g01450的804与805间多了―CAT‖,编码1个His,该氨基酸不在保守结构域上。Fc MYC2基因仅有一个外显子,无内含子,与甜橙基因Cs5g01450相同。在+408和+1320位点上,RA和HP中都检测到了SNP位点的变异,这些SNP位点位于密码子的第3位,未造成氨基酸的改变。用Fc MYC2的碱基和氨基酸比对柑橘中甜橙和克里曼丁两个基因组数据库,仅有甜橙的Cs5g01450（或orange1.1g010053m）和克里曼丁中的Ciclev10019730m序列一致性极高（E-value=0.0,per.Ident>99%）,且再无其它高相似性的基因,因此推测它们应为同一基因。柑橘的Fc MYC2与其它物种的MYC2基因在碱基序列上差异极大,进化分析发现其与最近缘的油菜MYC2-like基因自展值仅46%。尽管Fc MYC2编码的氨基酸在保守结构域的序列上保守性很高,但在非保守结构域区域,氨基酸序列的同源性极低。这说明柑橘的Fc MYC2是一个序列特异性极高的MYC2型b HLH家族转录调控因子基因。亚细胞定位显示Fc MYC2定位于细胞核中。Fc MYC2的表达受到Me JA的诱导,在Me JA处理后6 h达到最高表达水平。6.Fc MYC2的表达水平与精油的合成密切相关Fc MYC2在HP的茎表皮、叶片、花瓣中表达水平与根相当,都处于极低的水平,仅在有少量油胞的果皮中表达水平相对较高（P<0.05）,但明显低于在RA的茎、叶和果皮中的表达水平。在RA组织中,无油胞的根中Fc MYC2同样处于极低的表达水平,与HP的根相当。但在其它组织中,Fc MYC2都表现出较高的表达水平,特别是在精油含量最高的果皮中,Fc MYC2表达水平也是最高,其次是叶片和茎表皮中也有很高的表达水平。综合以上分析,不难看出,Fc MYC2在精油含量高的组织中表达水平更高。对HP和7个不同类型柑橘品种果皮中的Fc MYC2进行表达分析和果皮精油含量的滴定。结果表明Fc MYC2在油胞密集的品种中的表达水平显著高于HP,表达水平较低的枳中Fc MYC2的表达量也是HP的30倍以上,可见Fc MYC2在HP中的低表达具有非常明显的特异性。精油含量分析显示,HP果皮精油含量仅0.09 mg·g-1,其它几个柑橘品种果皮精油含量在4.49-18.23 mg·g-1之间,远高于HP。相关分析显示,柑橘果皮中Fc MYC2的表达水平与其精油含量呈极显著正相关（r=0.880,P<0.01）。7.Fc MYC2的调控单倍和倍半萜的合成分别构建了Fc MYC2的超表达载体、RNA干扰载体和基因编辑载体,利用农杆菌转化锦橙上胚轴。获得了97株Fc MYC2转基因植株,其中38株表现出油胞分泌腔细小或无肉眼可见分泌腔。基因表达分析显示,超表达植株中Fc MYC2的表达水平极显著地提高,干扰植株中Fc MYC2的表达水平极低。对基因编辑的植株进行测序分析显示,部分植株中的Fc MYC2实现了完全的编辑,这些编辑分别造成移码突变、翻译提前终止、长片段删除等导致蛋白功能丧失的突变。精油成分分析表明,超表达组植株无论是精油含量、成分类型的比例与对照组都没有发生明显的变化,10个含量较高的成分都是柠檬烯、香茅醛、柠檬醛、邻甲氨基苯甲酸甲酯、β-柠檬醛、桧烯、β-罗勒烯、β-石竹烯、3-蒈烯和芳樟醇,分别占对照植株的总挥发性精油成分总量的82.28%和超表达植株挥发性精油成分总量的85.69%。另外,单萜烯作为柑橘精油的主要成分,在超表达锦橙、干扰锦橙及对照锦橙中的含量比率非常近似,都在50%以上。干扰植株中叶片总精油含量降为对照的12.65%,单萜和倍半萜含量显著降低,特别是单萜氧化物含量和倍半萜氧化物含量的比例,但单萜烯和倍半萜烯含量的比例却有所上升。基因编辑植株中总精油含量极低,仅为对照的1.52%,仅残存极微量的单萜柠檬烯和β-环柠檬醛,倍半萜完全未检出。可见,降低Fc MYC2的表达水平会导致单萜和倍半萜合成量的降低,敲除Fc MYC2会造成单萜和倍半萜合成基本终止。因此,通过本研究的结果可以基本确定Fc MYC2是调控柑橘单萜和倍半萜合成的关键基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 植物精油概述
•   1.2 植物萜类生物合成途径
•   1.3 萜类合成的转录调控
•   1.4 柑橘油胞与精油研究进展
• 第2章 引言
• 第3章 金柑油胞发育与精油成分分析
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 金柑果实及油胞性状测量
•     3.1.3 精油成分分析
•     3.1.4 数据分析与制图
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 金柑果实发育过程中果皮油胞性状调查
•     3.2.2 金柑果皮挥发性精油成分分析
•   3.3 讨论
•     3.3.1 金柑果实发育过程中油胞发育及果皮精油的积累特征
•     3.3.2 果实发育过程中果皮精油成分的变化
•     3.3.3 果皮精油含量的增加是由单萜和倍半萜含量增加造成的
• 第4章 基于RNA-Seq筛选调控精油合成的关键基因
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 叶片及果皮油胞观察与计数
•     4.1.3 果皮精油含量的测定
•     4.1.4 RNA的提取
•     4.1.5 RNA-seq
•     4.1.6 qRT-PCR分析
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 HP和 RA叶片和果皮外观和油胞形态比较
•     4.2.2 HP和 RA果皮精油含量分析
•     4.2.3 RNA-seq数据比对分析
•     4.2.4 DEGs的 GO和 KEGG富集
•     4.2.5 萜类合成相关基因的分析
•     4.2.6 转录调控基因的分析
•   4.3 讨论
• 第5章 FcMYC2 的序列和表达特征
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 引物
•     5.1.2 FcMYC2 基因的克隆
•     5.1.3 FcMYC2 序列分析
•     5.1.4 FcMYC2 的亚细胞定位
•     5.1.5 FcMYC2 的表达特征分析
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 FcMYC2 全长序列的获得
•     5.2.2 FcMYC2 的碱基和氨基酸序列分析
•     5.2.3 FcMYC2 的亚细胞定位
•     5.2.4 FcMYC2的Me JA诱导
•     5.2.5 FcMYC2 的组织表达特征
•     5.2.6 FcMYC2 在不同柑橘品种果皮中的表达及精油含量分析
•   5.3 讨论
•     5.3.1 柑橘的FcMYC2 是一个序列特异性极高的MYC2型bHLH家族基因
•     5.3.2 FcMYC2 的表达水平与精油的合成密切相关
• 第6章 转基因验证FcMYC2 对柑橘精油合成的影响
•   6.1 材料与方法
•     6.1.1 引物
•     6.1.2 FcMYC2 的表达载体构建
•     6.1.3 遗传转化
•     6.1.4 转基因材料表型分析
•     6.1.5 编辑位点测序分析
•     6.1.6 转基因材料的基因表达分析及挥发性精油成分分析
•   6.2 结果与分析
•     6.2.1 转基因植株的获得
•     6.2.2 转基因植株的表型变异
•     6.2.3 基因编辑植株的编辑特征分析
•     6.2.4 转基因植株材料的基因表达分析
•     6.2.5 转基因植株的挥发性精油成分分析
•   6.3 讨论
•     6.3.1 超表达FcMYC2 未能提高锦橙叶片精油的含量
•     6.3.2 转基因植株油胞分泌腔细小的原因
• 第7章 讨论与结论
•   7.1 讨论
•   7.2 结论
• 参考文献
• 附录
•   附录 Ⅰ 缩略词
•   附录 Ⅱ PEG介导的拟南芥原生质体转化
• 致谢
• 发表论文及参与课题

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘小丰

导师: 赵晓春

关键词: 滑皮金柑,精油合成,转录调控因子,功能验证

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,一般化学工业

单位: 西南大学

分类号: Q943.2;TQ654.2

DOI: 10.27684/d.cnki.gxndx.2019.000056

总页数: 122

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