湖南省湘乡市中医医院湖南湘乡411400
【摘要】目的：探讨STZ诱导小鼠AD样症状运用二甲双胍的保护效果。方法：通过Morris水迷宫试验对二甲双胍对STZ侧脑室注射诱导的AD动物模型的学习记忆能力的影响进行评估，并且运用蛋白免疫印迹法对二甲双胍对AD动物模型脑内细胞骨架Tau蛋白磷酸化和蛋白神经丝蛋白的表达水平的影响进行分析。结果：定位航行试验中，与对照组相比，STZ组的路径长度和逃避潜伏期增加明显，并且相比较STZ组而言，二甲双胍组的路径长度和逃避潜伏期减少明显；同时，二甲双胍组、STZ组以及对照组的穿越匿平台次数比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：二甲双胍能够使STZ诱导小鼠AD样的学习记忆能力减退得到改善。
【关键词】链脲佐菌素、阿尔采末病、二甲双胍
阿尔采末病（AD）的神经病理变化主要为细胞外的老年斑沉积和细胞内的神经原纤维缠结（NFT），并且还合并神经突触的退化和神经元凋亡等，其中患者的痴呆程度与NFT数量呈现出正比关系，也是导致AD患者神经元退化的一个重要病理学基础[1]。二甲双胍作为一种胰岛素增敏剂，在糖尿病治疗中得到广泛运用，有研究发现，二甲双胍能够利用mTOR信号通路使细胞内的tau磷酸化水平降低，说明二甲双胍可以作为治疗AD的一种潜在药物。因此，本文对二甲双胍运用在STZ诱导小鼠AD样症状的保护价值进行了探讨，如下报道。
1资料和方法
1.1一般资料
选择30只昆明种小白鼠，平均体质量为（20.1±1.9）g，均健康且学习记忆力均等。
1.2方法
1.2.1动物分组和模型制备
随机将30只小白鼠分为3组，每组10只，分别为二甲双胍治疗组（STZ+Met组）、模型组（STZ组）以及正常对照组（CON组）。运用5%戊巴比妥钠80mg.kg-1对各组小组进行腹腔注射麻醉，在脑立体定位仪上固定，将小鼠脑立体定位图谱作为依据，于头顶部正中作一个切口，使前卤充分暴露，在矢状缝旁开1.5mm、前卤后1.0mm处将颅脑钻破，将3mg.kg-1二甲双胍分别注入二甲双胍治疗组和模型组，并且将等量生理盐水注入正常对照组，完成注射后，留针10min。退针后，常规消毒，对切口进行缝合，膈2天将缝线剪开，重复注入液体，方法与剂量与上述一致。
1.2.2Morris水迷宫试验
给药14d后，三组均行Morris水迷宫试验：①定位航行试验：在平台象限外随机选择3个距离等同于平台的点作为入水点，使其自由游泳，运用自动摄像系统对小鼠的逃避潜伏期（寻找平台时间）进行记录，连续4d；②空间探索试验：结束定位航行试验后，将平台撤除，选择同一相同点将小鼠放入水中，对小鼠入水后90s的游泳路径进行记录，对穿越原平台区域次数和游泳轨迹进行分析。
1.2.3神经丝的相关蛋白磷酸化表达和蛋白免疫印迹试验检测tau
完成Morris水迷宫试验后，将各组小组处死，快速在冰上取脑后，存放于-80°C冰箱中，取出50mg冻存的脑组织，分别加入蛋白酶抑制剂和组织裂解液，对总蛋白进行抽提，冻存于-80°C冰箱中。同时，运用BCA法对蛋白浓度进行检测，SDS-PAGE电泳，PVDF膜湿转，加入一抗，在4°C下存放一夜，洗膜，ECL发光显色，并且运用扫描仪对电泳条带进行扫描，运用Gel-pro32软件分析和处理结果条带。
1.3统计学分析
运用SPSS13.5统计学软件分析数据，运用x±s表示实验结果，运用LSD’sposthoctest和ANOVA检验对比，以P<0.05表示有差异。
2结果
2.1Morris水迷宫试验结果
定位航行试验中，与对照组相比，STZ组的路径长度和逃避潜伏期增加明显，并且相比较STZ组而言，二甲双胍组的路径长度和逃避潜伏期减少明显，见图1；同时，二甲双胍组、STZ组以及对照组的穿越匿平台次数比较差异有统计学意义（P<0.05），见图2。
图2
2.2Westernblot半定量分析结果
运用O-GlcNAc糖基化抗体RL2和神经丝蛋白特异性磷酸化抗体SMI3l能够对小鼠脑组织的O-GIcNAc糖基化和神经丝蛋白磷酸化表达变化进行检测，并且RL2/R61d与SMI31/R61d比值能够将相同蛋白量条件下RL2和SMI31的表达变化充分反映出来。与对照组相比，STZ组的神经丝磷酸化表达增加明显（P<0.05），而糖基化表达减少明显（P<0.05）；同时，相比较STZ组而言，二甲双胍治疗组的神经丝磷酸化表达减少明显，糖基化表达增加明显（P<0.05），见图3、4。
图4
3讨论
有研究发现，Ins/IR信号转导系统障碍是诱发AD脑内葡萄糖/能量代谢异常的一个重要因素，使糖基化终末产物生成，从而形成NFT和Aβ[2]。STZ作为亚硝基脲的一种衍生物，含有β细胞毒性，STZ能够对Ins/IR信号转导通路造成破坏，使小鼠脑内葡萄糖利用降低，使脑能量代谢出现障碍，减少GTP和ATP生成，损伤认知功能相关皮层的神经细胞功能，对突触可塑性和突出传递产生影响，从而诱发学习记忆功能障碍[3]。本次研究结果显示，随着训练时间的增加，三组小鼠寻找水下平台潜伏期的时间和通过的路径长度明显缩短，并且与对照组相比，STZ组的路径长度和逃避潜伏期较长，但是经二甲双胍治疗后，小鼠的路径长度与潜伏期缩短明显，说明脑室注射STZ对小鼠的学习能力造成损伤，而二甲双胍能够拮抗这种损伤，保护小鼠学习和记忆障碍。有报道显示，记忆与认知与脑内糖代谢减弱密切相关，本次研究发现，经二甲双胍治疗后，小鼠的学习记忆和认知能力迅速上升，其原因可能与STZ能够使脑内糖代谢紊乱和胰岛素信号恢复正常有关。同时，在蛋白印迹实验结果中，与对照组比较，STZ组的神经丝磷酸化水平上升明显，而糖基化水平下降，说明二甲双胍能够使小鼠AD样学习记忆能力的减退得到改善，使AD样细胞骨架的磷酸化水平降低，使糖基化水平升高。
综上所述，二甲双胍能够改善STZ诱导小鼠AD样的学习记忆能力减退，但是其作用机制还需要进一步研究。
参考文献：
[1]宋金芝，熊慧，丁玲，郑晨.二甲双胍对STZ诱导小鼠AD样症状的保护作用的研究[J].中国药理学通报，2013，06（20）：871-876.
[2]苏存锦.二甲双胍对MPTP/p帕金森病模型小鼠的神经保护作用[J].南京医科大学学报，2013，19（2）：224-225.
[3]王凯.长时程二甲双胍预处理通过诱导自噬发挥脑保护作用的机制研究[J].第四军医大学学报，2015，20（19）：178-179.