tRNA片段检测方法的建立及在胃癌细胞中的应用

论文摘要

tRNA是蛋白质合成过程中重要的接头分子,同时也参与细胞通讯和逆转录的过程。研究表明,在生理状态下,小鼠精子中有大量的tRNA片段存在,并且在多种应激条件下细胞内tRNA发生剪切,产生大量tRNA片段,它们具有重要的生物学功能。本研究将领域内提取细菌tRNA技术加以优化应用于小鼠组织和细胞,并结合qPCR技术,由此建立一种样品前处理简便、检测快捷、适用于高通量检测组织细胞内tRNA片段的方法,为tRNA片段检测分析及其功能的研究提供高效的方法。应用该方法进行癌症标志物的筛选,并探究DNMT2和多糖对细胞应激耐受性和tRNA稳定性的影响。具体内容如下:1.tRNA片段检测方法的建立（1）tRNA提取方法优化本领域提取细菌tRNA的方法优化,得到优化后的方法去除了28S rRNA杂带所得的总tRNA没有明显的拖带现象,可以满足本研究接下来的工作。（2）小鼠精子内tRNA片段检测对比从小鼠精子、睾丸和肝脏中提取出的tRNA,3ˊ端连接linker,逆转录成cDNA。用5.8s RNA作为内参,设计tRNAGlu、tRNAGly、tRNAAsp、以及3ˊlinker和5.8sRNA的引物,利用qPCR技术检测。检测结果显示小鼠精子中tRNA片段表达量远高于肝脏和睾丸中的,与课题组获得的结果一致,与小鼠精子中含有大量tRNA片段的文献报道也一致。该方法不需要使用同位素标记、探针杂交,样品前处理简单,上样量小,操作简便,适用于小鼠组织细胞的tRNA片段的检测。2.胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞SGC7901中tRNA片段表达水平提取胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞中的tRNA用该方法检测胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞内的tRNAGlu、tRNAGly、tRNAAsp、tRNAVal、tRNACys的tRNA片段。发现癌症细胞中的tRNA片段相对表达量要远低于正常细胞,tRNAGlu、tRNAGly和tRNAAsp的片段具有成为新的癌症标志物的潜力。3.应激条件下tRNA片段表达情况和过表达DNMT2对细胞tRNA应激耐受性的影响利用胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞两种细胞建立高糖应激、缺氧应激、氧化应激应三种细胞应激模型,用建立的方法检测模型细胞的tRNA片段表达量。发现应激条件下正常细胞和癌细胞中的tRNA片段表达量都升高,与应激条件下细胞内的tRNA会被性剪切为特异小RNA片段的报道一致,表明该方法也适用于细胞系。并且随着应激条件的持续存在,细胞内的tRNA片段会减少,可能是因为细胞的应激耐受性提高。接着在细胞中过表达DNMT2,验证了DNMT2能够提高细胞的应激耐受性,能够提高tRNA的应激耐受性,减少细胞内tRNA片段的表达,保护tRNA在应激条件下不被剪切。4.不同多糖对细胞中tRNA应激耐受性的影响在应激细胞模型中加入多糖处理,分别检测多糖对细胞增殖,tRNA片段表达和DNMT2表达的作用。发现,多糖PGA4-3b、CFAA-1、LJW0F1对应激条件下细胞增殖没有明显的影响,多糖WSS25对应激条件下细胞增殖有抑制作用。四种多糖对细胞的作用并不是通过DNMT2实现的,对tRNA也不具有明显的保护作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 1 文献综述
•   1.1 问题的由来
•   1.2 非编码小RNA的研究进展
•     1.2.1 miRNAs
•     1.2.2 piRNAs
•     1.2.3 snoRNAs
•     1.2.4 tRNA衍生的RNA片段
•   1.3 tRNA简介
•     1.3.1 tRNA的结构与功能
•     1.3.2 tRNA的转录和加工
•     1.3.3 tRNA的功能
•     1.3.4 tRNA片段的产生
•     1.3.5 tRNA片段的功能
•   1.4 RNA检测方法概述
•   1.5 植物多糖概述
•   1.6 DNMT2的结构与功能
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 试验动物组织及细胞
•     3.1.2 主要试剂与药品
•     3.1.3 引物
•     3.1.4 常用培养基
•     3.1.5 常用缓冲液
•   3.2 主要仪器设备
•   3.3 试验方法
•     3.3.1 小鼠成熟精子的获取
•     3.3.2 细胞培养
•     3.3.3 tRNA的提取
•     3.3.4 总RNA提取
•     3.3.5 tRNA检测qPCR法
•     3.3.6 CCK-8试验
•     3.3.7 Western-blot
• 4 结果与分析
•   4.1 tRNA片段检测方法的建立
•     4.1.1 tRNA提取方法的优化
•     4.1.2 tRNA完整性检测
•     4.1.3 qPCR检测精子tRNA片段
•   4.2 胃黏膜上皮细胞系GES-1和胃癌细胞系SGC7901中tRNA片段表达水平
•   4.3 缺氧、氧化和高糖应激条件下胃癌细胞与正常细胞中tRNA片段的表达情况
•     4.3.1 几种应激模型的建立
•     4.3.2 应激条件下tRNA片段的检测
•   4.4 过表达DNMT2对细胞tRNA应激耐受性的影响
•     4.4.1 过表达DNMT2对细胞抗氧化应激的影响
•     4.4.2 过表达DNMT2对应激状态下细胞tRNA片段产生的影响
•   4.5 不同多糖对细胞中tRNA应激耐受性的影响
•     4.5.1 多糖对氧化应激下细胞增殖的影响
•     4.5.2 多糖对细胞应激状态下tRNA片段表达的影响
•     4.5.3 多糖对细胞中DNMT2表达的影响
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈勇

导师: 刘翠平,吴健

关键词: 片段,检测方法,胃癌细胞,植物多糖

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 华中农业大学

分类号: R735.2;Q503

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000609

总页数: 62

文件大小: 4720K

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