酶联免疫吸附试验中的相关因素与结果分析

酶联免疫吸附试验中的相关因素与结果分析

李剑华

【中图分类号】R352【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)04-0216-01

酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunoadsordentassay;ELISA)是医学检验的免疫学检验方法之一,已经广泛应用到对病原微生物的免疫学检查试验中。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体,并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使抗原抗体反应在固相载体表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除,最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。用ELISA法检测乙肝病毒感染者的血清标志物(两对半)是目前最常用的实验室检验方法。和任何实验室检查方法一样,ELISA存在少量的假性结果(假阳性、假阴性),对临床诊断和治疗会有一定的影响。由于ELISA反应所测对象可以是抗原也可以是抗体,显色反应对结果的阴性和阳性也有两种不同的判断,所以这里以显色为阳性的模式为例归纳其影响因素如下。

1抗体的酶标记方法及标记效果测定

1.1标记方法:良好的酶结合物取决于两个条件:即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要,因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中,抗体的活性有所降低,故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白,最好使用亲和层析提纯的抗体,可提高敏感性,而且可稀释使用,减少非特异性吸附。

酶与抗体交联,常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行,标记效果好,特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为:将5μgHRP溶于0.5ml蒸馏水中,加入新鲜配制的0.06mol/L的过碘酸钠(NaIO4)水溶液0.5ml,混匀置4℃冰箱30分钟,取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml,混匀并装透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时(或过夜)使之结合,然后吸出,加硼氢化钠(NaBH4)溶液(5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小时,将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液,置4℃冰箱30分钟后离心,将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中,并对之透析过夜(4℃),次日离心除去不溶物,即得到酶标抗体,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,进行测定后,冷冻干燥或低温保存。

1.2酶标抗体标记效果测定:测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。

1.2.1酶与抗体的活性常用琼脂扩散或免疫电泳法,使抗原与抗体形成沉淀线,经PBS漂洗1天,再以蒸馏水浸泡1小时,将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色,如果出现应有的颜色反应,再用生理盐水浸泡,颜色仍然不褪,表示结合物既有酶的活性,也有抗体活性。良好的结合物在显色后,琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定,此法不仅可以测定标记效果,还可以确定酶标抗体的使用浓度。

1.2.2结合物的定量测定一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定,然后按下列公式计算:

酶量(mg/ml)=OD403×0.42

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62

对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量,按下列公式计算:

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.34)×0.62

已知酶量和IgG量后,即可计算出标记抗体的摩尔(mol)比值。

HRP/IgG摩尔比值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4

结合物中酶总量=HRP(mg/ml)×结合物溶液量

结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%

用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般,为500(g/ml时效果较好,达1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠,所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般,1.0时效果较好,1.5-2.0时最好。酶结合率为7%时效果一般,为9%-10%较好,达30%以上时最好。

ELISA方法的基本类型、用途及操作程序

根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型:一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA,即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA,称为布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中,又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。

2假阴性因素分析

2.1试剂在生产线上,发生少见的“漏包”,或包被的抗原或抗体失活或活性不足。

2.2试剂的运输、保管不当。如:运输过程中温度过高、保存试剂的环境不好,导致试剂中的标记物活性降低,或者中和试剂完全失活。

2.3操作过程中的误差,加样中出现错、少、漏的现象;加显色剂速度慢,观察时间迟,使褪色反应快的出现假的阴性;洗涤过程中,用力过猛、浸泡时间太长、反复洗涤次数太多,使反应产生的免疫复合物丢失。

2.4忽略临界值血清的作用,在试验中只做阳性对照,从而失去临界点的控制,造成假阴性。

2.5判读结果或登记、发报告时错位,出现错报的假阴性结果。

3假阳性时的影响因素

3.1操作的影响。超过规定量的加样量,使临界点附近的阴性成为假的阳性;洗涤过程中有溢出现象,使强阳性孔的反应液污染附近的阴性孔而出现假的阳性;洗涤时间或次数不够,使反应试剂残留,出现假的阳性;使用污染的加样吸头或反应孔;反复使用的底物液被污染或受到强光照射时间长,也会出现假的阳性。

3.2患者自身的免疫情况特殊。有自身免疫疾病的患者血清中,其IgG抗体等特殊成分会在ELISA反应过程中有一定的吸附作用,发生假的显色反应而出现假阳性。

3.3血清标本的影响。如冰冻标本的反复冻融、标本存放时间太长而长菌、标本溶血、高血脂的标本等等,均易出现假的阳性结果。

3.4酶标仪使用的影响。酶标仪是ELISA试验反应结果所必要的仪器,但在使用过程中也要注意一个特殊情况。由于酶标仪是对反应孔进行垂直比色,当反应板底部有污物时,很容易出现假的吸光度高值,导致假的阳性结果的出现。

3.5判读结果或登记、发报告时错位,出现错报的假阳性结果。

作者单位:154600黑龙江省大庆油田总医院

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