钟晓鸣1骆萍2谢洪辉1
（1江西省肿瘤医院放疗科330029；2南昌市三医院乳腺肿瘤科330003）
【中图分类号】R739.6【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）03-0038-03
【摘要】目的探讨鼻咽癌组织中细胞自发凋亡及凋亡基因P53、bcl-2的表达在预测放射敏感性中的意义。方法对60例初治、无远处转移、放疗前鼻咽癌患者活检标本分别采用TUNEL法检测细胞自发凋亡，免疫组化技术检测P53和bcl-2基因的表达情况；临床观测患者放疗过程中鼻咽部肿瘤的消退情况。结果在鼻咽癌组织中突变型P53和bcI—2基因的表达水平呈正相关（r=0.642，P<0.05）；鼻咽癌组织中突变型P53基因表达水平与细胞自发凋亡率呈负相关（r=-0.865，P<0.05）；鼻咽癌组织中bcl-2基因表达水平与细胞自发凋亡率呈负相关（r=-0.675，P<0.05）。突变型P53基因阳性表达水平与鼻咽癌瘤体的消退率呈负相关；bcl-2基因阳性表达水平与鼻咽癌瘤体的消退率呈负相关（放疗40Gy时，Rs=-0.751；放疗70Gy时，Rs=-0.820；P<0.05）；自发凋亡率与鼻咽癌瘤体的消退率呈显著正相关（放疗剂量为40Gy时，r=0.869；放疗剂量为70Gy时，r=0.918；P<0.01）。患者的性别、年龄及分期与鼻咽癌瘤体的消退率均无相关性(P>0.05)。结论本研究表明鼻咽癌中细胞自发凋亡率及凋亡相关基因P53、bcl-2的表达与即时疗效密切相关,P53、bcl-2基因之间可能存在协同作用；细胞自发凋亡率和P53、bcl-2蛋白可以作为鼻咽癌放射敏感性可能的预测指标,联合检测自发凋亡率和P53、bcl-2蛋白意义更大。
【关键词】鼻咽癌细胞凋亡P53bcl-2放射敏感性
鼻咽癌是我国最常见的头颈部恶性肿瘤，放射治疗是目前最主要的治疗手段，而肿瘤放射敏感性是影响肿瘤放射治疗成败的重要因素之一。如何预测及提高肿瘤细胞的放射敏感性，一直是放射肿瘤学家和放射生物学家关注的问题。在放射肿瘤学领域，凋亡被认为是一种重要的放射敏感性指标，而且许多基因参与凋亡的调控，其中P53和bcl-2尤为突出。本研究通过对60例放疗前鼻咽癌患者分别采用TUNEL法检测细胞自发凋亡率、免疫组化技术检测P53和bcl-2基因的表达，结合临床观测肿瘤消退情况，探讨鼻咽癌组织中细胞自发凋亡率及凋亡相关基因P53和bcl-2的表达与临床放射敏感性的关系,为今后临床制定个体化放射治疗方案及疗效预测提供参考。
1.材料和方法
1.1组织标本：60例无远处转移，放疗前的初治鼻咽癌患者。38例男性，22例女性。年龄19～68岁，病理类型均为低分化鳞癌。据08福州分期：Ⅰ期0例，Ⅱ期11例，Ⅲ期49例,IV期0例。
1.2仪器及试剂：TUNEL法试剂盒,HCBiotinBlockKit试剂盒（P53﹑bcl-2），PrimusM6MV数字化全自动多叶光栅直线加速器,三维放射治疗计划系统。
1.3原位末端标记法：使用DNA酶I加rTdT反应液为阳性对照，去rTdT反应液滴加PBS液替代作为阴性对照。具体步骤按试剂盒上的说明进行。
1.4采用免疫组化两步法检测P53、bcl-2，用购买试剂公司所提供的已知P53、bcl-2阳性的切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。
1.5统计方法:采用系统统计软件SPSS12.0进行方差齐性检验、单因素方差分析（Simple-wayANOVA）、多因素回归分析。p<0.05为有统计学意义。
2.结果
2.1突变型P53和bcl-2基因在鼻咽癌组织中的表达：P53和bcl-2基因表达分成—、十、十十、十十十4组。随着P53基因表达水平的增强，bcl-2基因的表达水平也呈增强趋势，在鼻咽癌组织中P53和bcl-2基因的表达水平呈正相关（r=0.642，P<0.05）。
2.2鼻咽癌中自发凋亡率与突变型P53和bcl-2基因表达水平的相关性结果显示：随着P53基因表达水平的增强，细胞自发凋亡率呈下降趋势，鼻咽癌组织中突变型P53阳性表达水平与细胞自发凋亡率呈负相关（r=-0.865，P<0.05）；随着bcl-2基因表达水平的增强，细胞自发凋亡率亦呈下降趋势，鼻咽癌组织中bcl-2基因表达水平与细胞自发凋亡率呈负相关（r=-0.675，P<0.05）。
2.3突变型P53和bcl-2基因表达及自发凋亡率与鼻咽癌瘤体消退率的关系：突变型P53基因阳性表达水平与鼻咽癌瘤体的消退率呈负相关（放疗40Gy时，Rs=-0.654；放疗70Gy时，Rs=-0.652；P<0.05）；bcl-2基因阳性表达水平与鼻咽癌瘤体的消退率呈负相关（放疗40Gy时，Rs=-0.751；放疗70Gy时，Rs=-0.820；P<0.05）。
2.4自发凋亡率与鼻咽癌瘤体的消退率呈显著正相关（线性相关分析，放疗剂量为40Gy时，r=0.869；放疗剂量为70Gy时，r=0.918；P<0.01）。
2.5放疗剂量40Gy和放疗剂量70Gy时鼻咽癌瘤体的消退率呈显著正相关（线性相关分析，r=0.931；P<0.01）。即放疗剂量40Gy和放疗剂量70Gy时鼻咽癌瘤体的消退率能同时反映瘤体的消退快慢。
患者的性别、年龄及分期与鼻咽癌瘤体的消退率统计学上均无相关性(多因素回归分析，P>0.05)。
3.讨论
细胞凋亡，又称细胞程序性死亡，是与细胞坏死不同的细胞死亡方式。细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，是细胞主动参与的“自杀”过程，很多基因直接参与了细胞凋亡的调控。野生型P53基因被认为是促细胞凋亡基因，正常情况下不能被免疫组化染色所检测[1]；突变型P53蛋白半衰期较野生型P53蛋白长，能沉积在细胞核中，故可以通过免疫组化染色检测出来[2]。因此，实验检测到的是突变型P53基因产物。bcl-2癌基因是抑制细胞凋亡的主要基因。P53与bcl-2基因均是细胞凋亡的重要相关基因，两者在凋亡的作用机理上不一样，但功能上可能存在相互联系。本研究发现在鼻咽癌组织中突变型P53和bcl-2基因的表达呈正相关，且随着两者表达的增强，凋亡指数明显下降，细胞发生凋亡的能力明显减低，突变型P53和bcl-2的表达与鼻咽癌细胞的自发凋亡率呈负相关。因此，我们认为P53与bcl-2基因在调节鼻咽癌细胞自发凋亡的过程中存在协同作用，其具体的机制尚不清。可能的机制为：发生突变的P53基因丧失对凋亡的诱导功能，同时因为丧失了通过激活bax基因达到对bcl-2基因的抑制作用，bcl-2基因的表达增强进一步阻滞凋亡的发生。因此，随着鼻咽癌中突变型P53基因产物的积聚，bcl-2基因的表达产物亦升高，两者表达的增强，均可导致肿瘤细胞自发凋亡的抑制。
准确地预测肿瘤细胞的放射敏感性，针对不同的肿瘤患者采用更合理更个性化的放疗方案，以增加局部控制率和减少正常组织的放射损害显得极为重要，也一直是放射肿瘤学家和放射生物学家研究的热门课题。人体肿瘤放射敏感性通常是指测量可引起肿瘤退缩的细胞死亡数。肿瘤的临床放射敏感性是指放射效应，反映了肿瘤缩小的程度和速度[3]。临床上通常按以下方法来测定肿瘤放射敏感性：①肿瘤在照射过程中消退的速度；②放射治疗完成后6—8周肿瘤完全消退的程度；③以5年存活率来衡量可治愈的效果。本研究是通过采用观测肿瘤在照射过程中消退的速度来评价肿瘤放射敏感性。也即是应用放疗40Gy和70Gy时鼻咽部瘤体体积的消退率(tumorregressionrate,TRR)来评价的:在鼻咽癌放疗前(GTV0)、放疗至40Gy(GTV40)和70Gy(GTV70)时进行影像学MR检查，并将MR扫描图像传入三维计划系统,勾画并计算靶体积。如此，既能反映了放疗中（40Gy）鼻咽肿瘤的退缩情况，又同时结合了放疗结束时（70Gy）的肿瘤消退情况。本研究中，放疗40Gy和放疗70Gy时鼻咽癌瘤体的消退率呈显著正相关，表明放疗40Gy和放疗70Gy时鼻咽癌瘤体的消退率能同时反映瘤体的消退快慢，用此标准反映肿瘤的消退率有实际意义。用肿瘤消退率这一评价指标的不足之处为：肿瘤消退率除了与肿瘤细胞的放射敏感性相关以外，还与组织中对老化或坏死细胞的清除速率相关[4]。本研究中，突变型P53和bcl-2的表达与鼻咽癌瘤体的消退率呈负相关，自发凋亡率与鼻咽癌瘤体的消退率呈显著正相关，随着鼻咽癌组织中自发凋亡指数的升高，鼻咽瘤体的消退速度显著增快，临床放射敏感性越高。
本研究结果显示，随着鼻咽癌中突变型P53基因表达的增强，bcl-2基因表达亦增强，自发凋亡率相应出现下降，细胞发生凋亡的能力减低，瘤体消退相对减慢，肿瘤消退率降低，临床放射敏感性亦下降。因此，本研究表明鼻咽癌中细胞自发凋亡率及凋亡相关基因P53、bcl-2的表达与即时疗效密切相关,P53、bcl-2基因之间可能存在协同作用；细胞自发凋亡率和P53、bcl-2蛋白可以作为鼻咽癌放射敏感性可能的预测指标,联合检测自发凋亡率和P53、bcl-2蛋白意义更大。
参考文献
[1].PorterPL，GrownAM，KramSG.eta1.WildspreadP53overexpressioninhumanmalignanttumors：animmuno-histochemicalstudyusingmethacarn—fixed，embededtissue[J].AmJPathol，1992，140(1)：145—153.
[2].ReichNC,OrenM,LevineAJ.TwodistinctmechanismsregulatethelevelsofacellulartumorantigenP53.MolCellBoil,1993,3:2143
[3].沈瑜.放射敏感性和放射可治愈性.见殷蔚伯，谷铣之主编.肿瘤放射治疗学[M].第3版.北京：中国协和医科大学出版社2002:07.
[4].高黎,杨伟志,袁智勇,等.改良“慧星”分析法检测鼻咽癌放射敏感性的初步研究[J].中华放射肿瘤学杂志,2004,13(1):39.