一、用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白(H)基因（论文文献综述）
薛晓茵[1]（2021）在《基于小反刍兽疫病毒H蛋白的间接ELISA方法建立及晶体培养》文中指出小反刍兽疫（Peste des petits ruminants,PPR）是绵羊、山羊等小反刍动物的烈性传染性病毒病,发病率和死亡率可达90%以上。其病原体为副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus,PPRV）。PPR是世界动物卫生组织（OIE）列出的必须报告疫病,也是我国规定的一类动物疫病。目前PPR尚无有效治疗手段,主要依靠疫苗接种进行防控,因此需要建立准确快速的抗体检测方法,评估疫苗免疫效果。H蛋白是PPRV结构蛋白中能刺激机体产生中和抗体的蛋白,具备建立ELISA抗体检测方法的潜质。蛋白质功能主要取决于空间结构,因而获得精准的蛋白质结构信息对研究蛋白质功能至关重要。了解PPRV H蛋白的具体结构有利于为新型检测技术及基因工程疫苗设计提供指导,目前副黏病毒科已有部分病毒的蛋白结构被解析出来,但小反刍兽疫病毒的H蛋白结构研究很少。本研究合成PPRV Nigeria/75/1株H蛋白基因序列,并利用酵母表达方法获得重组目的蛋白并进行纯化。对PPRV H蛋白的晶体培养条件进行了摸索。此外,以纯化后的H蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA方法,用于检测PPRV抗体,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时与国外商品化试剂盒进行比对试验。获得以下研究结果:1.成功构建pGAPZα-PPRV-H重组质粒,并获得重组蛋白。对Nigeria/75/1株的H蛋白基因进行密码子优化,并加入His标签,成功构建至pGAPZα载体中。转化至SMD1168工程菌中进行毕赤酵母表达,获得重组蛋白。用梯度浓度的含咪唑溶液纯化pGAPZα-PPRV-H蛋白。经过SDS-PAGE验证,所表达目的蛋白大小正确。经过Western Blot验证,所表达目的蛋白能够和PPRV阳性血清产生特异性反应,具有良好反应原性。2.初步获得PPRV-H蛋白晶体培养条件。PPRV-H蛋白结晶的条件为1 M BIS-TRIS p H 7.5,25%w/v聚乙二醇3350;0.1 M硫氰酸钾,30%w/v聚乙二醇单甲醚2000;0.1 M HEPES p H 7.5,0.2 M硫酸锂一水化合物,25%w/v聚乙二醇3350。3.成功建立PPRV间接ELISA抗体检测方法。抗原包被浓度为5μg/m L;封闭液为1%酪蛋白,条件为37℃封闭2 h;待检血清稀释度为1:5,反应条件为37℃孵育30 min;酶标二抗稀释度为1:3000,反应条件为37℃孵育30 min;显色液反应条件为37℃作用10 min;确定了临界值为0.320。在确定好基本条件后,对该方法进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明该方法与羊痘病毒、羊蓝舌病病毒、羊布氏杆菌、羊口疮病毒、口蹄疫病毒的阳性血清均无特异反应;PPRV阳性血清在稀释至1:800时仍能检测出阳性,敏感性良好;批间和批内变异系数在8.9%以内;与ID-vet商品化检测试剂盒符合率为93.97%。
冉伟[2]（2021）在《犬瘟热病毒对人SLAM受体适应机制及其在人SLAM转基因小鼠体内复制的研究》文中研究说明犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种多种动物共患传染病。信号淋巴细胞激活分子（Signalling lymphocyte activation molecular,SLAM）为CDV等麻疹病毒属成员感染宿主的主要受体,其在病毒跨种间传播及宿主致病性中起到重要作用。CDV H蛋白在识别病毒SLAM受体,介导病毒入侵和调节病毒毒力中发挥重要作用。近年来,随着生态环境变化和病毒变异,CDV自然宿主已由犬科、猫科和浣熊科等动物扩大到灵长目的猕猴。因此,CDV能否通过人SLAM受体突破物种屏障而传播给人类的科学问题值得我们关注。我们在前期克隆得到CDV人SLAM（hSLAM）受体适应株5804Pe/H-VHS基础上,证实CDV-H蛋白D540G氨基酸突变可介导病毒对表达hSLAM受体的Vero细胞（Vero-hSLAM）有效感染。本研究中,我们进一步通过hSLAM受体阻断试验、H/hSLAM互作三维模型、免疫印迹、H/hSLAM免疫共沉淀、人PBMC体外感染和血清抗体交叉中和保护实验等技术,研究了5804Pe/H-VHS株适应hSLAM受体的分子机制。实验结果表明:（1）D540G突变未改变CDV H蛋白在细胞膜上的表达量（p>0.05）;（2）抗hSLAM单克隆抗体可显着阻断CDV对Vero-hSLAM细胞的感染（p<0.05）;（3）CDV H蛋白D540G突变后可能分别与hSLAM 38位（Q）和41位（S）氨基酸产生分子间作用力;（4）D540G突变未明显增强H/hSLAM蛋白之间相互作用（p>0.05）;（5）5804Pe/H-VHS株能在体外有效感染人PBMC(病毒载量可达104.50TCID50/mL)（p<0.01）,且可明显抑制PBMC的增殖活性（p<0.05）;（6）CDV疫苗免疫血清可对5804Pe/H-VHS株产生交叉免疫作用（p<0.01）。为进一步明确病毒在体内致病性,本研究分别以5804Pe/H-VHS和5804Pe/H株(106.0TCID50)鼻腔感染hSLAM转基因小鼠hSLAM（+/+）/STAT1（-/-）。感染后7天,将小鼠麻醉后进行剖检观察。分别应用RT-PCR和Vero-hSLAM细胞检测组织中病毒载量,通过激光共聚焦技术研究组织中病毒与hSLAM受体共定位情况。上述结果显示,（1）与5804Pe/H感染组相比,5804Pe/H-VHS感染组脾脏显着肿大、增重（p<0.01）;（2）5804Pe/H-VHS感染组中,CDV RNA在脾脏、肺脏中呈强阳性,在淋巴结、胸腺和肾脏呈弱阳性,脑呈阴性,而5804Pe/H感染组,除胸腺呈弱阳性外,其余组织均为阴性;（3）5804Pe/H-VHS感染组在免疫细胞和器官（PBMC、脾脏、淋巴结、胸腺）和上皮组组中病毒载量均显着高于5804Pe/H感染组（p<0.01）;（4）5804Pe/H-VHS感染组脾脏、肺脏和淋巴结中病毒与hSLAM发生共定位,而5804Pe/H感染组中未观察到病毒e GFP荧光。综上,CDV 5804Pe/H-VHS株能体外有效感染人PBMC,并可抑制其细胞增殖活性;病毒感染hSLAM转基因小鼠后,可在其免疫器官和上皮组织中复制。本研究初步揭示了CDV适应hSLAM受体的分子机制,建立了CDV感染小鼠的致病模型,为进一步评估CDV跨种间感染人类的风险提供了研究基础。
孙伟伟[3]（2020）在《犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立》文中认为犬瘟热（canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）感染引起的消化道、呼吸道、神经系统异常以及机体免疫抑制的传染性疾病。近年来,我国CD呈现出新的流行特点:毒株变异快、感染谱不断扩大、混合感染现象普遍,由其引发的免疫抑制致使疫苗免疫失败时有发生,对养犬业和毛皮动物养殖造成的直接及间接经济损失巨大,寻求防控该病已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。为此,本研究旨在了解江苏部分地区犬瘟热流行情况,分析病毒H蛋白的遗传变异规律,丰富了CDV流行毒株资源库;同时,扩充已建立的CDV单克隆抗体杂交瘤细胞株库,从中筛选具有广谱中和活性单克隆抗体;基于重组H蛋白和单克隆抗体建立CDV抗原与抗体竞争ELISA检测方法,用于CD病原学和血清学检测,为CDV的感染监测提供技术支撑。主要研究内容包括:本研究收集了60份2017-2019年江苏部分地区疑似犬瘟热病料,采用RT-PCR法鉴定了22份病料样品为CDV核酸阳性,进一步通过扩增完整H基因、核酸测序、BLAST比对、同源性比对、遗传进化分析和N-糖基化位点统计分析显示,其中18份America-1型毒株与疫苗株（Ondetstepoort株）高度同源;其余4份属Asia-1型毒株（分别命名为YZ-4、NJ-13、NJ-21、YZ-27）,与疫苗株氨基酸同源性在90.1%-91.2%之间,毒株间同源性为97.2%-99.8%,与国内流行Asia-1型毒株同源性较高（99.7%-100%）;4株Asia-1型毒株在H蛋白584-586位点均具有潜在的N-糖基化修饰,具有Asia-1型强毒株的分子特征;另外,YZ-4株、NJ-21株和YZ-27株H蛋白SLAM受体结合区域未发生改变（519R/530G/549Y）,而NJ-13株的受体结合区域突变为519R/530G/549H,提示该毒株与宿主结合能力可能发生改变。本研究扩充了CDV单克隆抗体杂交瘤细胞株库,基于重组H蛋白的间接ELISA法筛选获得7株稳定分泌抗H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株（分别命名为3B1、3B5、3C5、3D5、5A6、4G12和7B2）,由此产生的抗体亚类均鉴定为Ig G1κ。间接免疫荧光试验显示上述单克隆抗体均能与CDV发生反应,不与犬细小病毒、犬冠状病毒以及犬流感病毒反应,具有良好特异性;病毒中和试验测定其培养上清的抗体中和效价为24-28,诱生BALB/c小鼠腹水的抗体中和效价为102-106,其中3B5、5A6、4G12、7B2之间的叠加系数均在50%以上,表明这4株单克隆抗体识别不同抗原表位;连续传代检测显示在第20代仍具有高效分泌抗体的能力,表明其稳定性良好;另外,3B5、5A6、4G12和7B2除能中和Ondetstepoort疫苗株（America-1型）外,还能中和当前流行的Asia-1型CDV毒株,其中3B5抗Ondetstepoort株和YZ-4株的中和效价分别为28和27,具有较好的广谱中和活性。本研究以HRP酶标的3B5单克隆抗体和重组H蛋白为基础建立了CDV抗体竞争ELISA检测方法,采用方阵滴定法CDV抗体竞争ELISA检测方法的最佳包被抗原（重组H蛋白）浓度为4μg/m L,H-RP酶标3B5抗体最佳稀释浓度为1:3 200,待检血清最佳稀释浓度为1:8,血清样本抑制率（PI）≥45%判定为阳性,与国外商品化的犬瘟热抗体试剂盒相比,检测结果符合率为97%,具有良好的特异性和敏感性。本研究以HRP酶标的重组H蛋白和3B5单克隆抗体为基础建立了CDV抗原竞争ELISA检测方法,采用方阵滴定法确定CDV抗原竞争ELISA检测方法的最佳包被抗体（3B5）浓度为2μg/m L、HRP酶标重组H蛋白最佳稀释浓度为1:1 600,经反应条件优化,该方法最低病毒检测量为103TCID50/m L,特异性和重复稳定性良好,与RT-PCR法检测临床样品的符合率达100%。综上,本研究对江苏部分地区开展了CDV分子流行病学调查,分析流行毒株的遗传变异规律,及时总结其流行病学态势和分子变异情况;同时,扩充了CDV毒株资源库和CDV单克隆抗体杂交瘤细胞株库,筛选了具有广谱中和活性的抗H蛋白单克隆抗体;以此建立了CDV抗原和抗体竞争ELISA检测方法,完善CD病原学和血清学检测方法和评价CDV感染水平,为科学防控CD提供技术支撑。
苏瑞红[4]（2018）在《犬瘟热病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立》文中研究指明犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus,CDV）是引起狐、貂、貉等毛皮动物及犬、熊猫、虎等动物犬瘟热的病原。以宠物犬来说,目前,接种疫苗是防治该病的主要措施。由于疫苗抗原性差异、高水平母源抗体或免疫犬血清抗体的干扰,往往造成免疫失败而引起犬瘟热的发生,或因血清抗体水平过低不能提供保护作用而发病。合理的免疫时机应以抗体水平检测结果为基础。临床上应用的抗体检测方法有ELISA、血清中和试验、间接免疫荧光试验等,这些方法快速、准确、便于检测大量样品。但这些检测方法操作较复杂或需要特殊仪器,可能会影响宠物犬母源抗体和免疫抗体检测的普及率。因此,定期分离CDV现地流行毒株,分析其抗原性遗传演变情况,选择抗原性一致的疫苗免疫接种;建立一种简便、经济、能够及时检测单份血清样品的CDV血清抗体检测方法,对有效预防犬瘟热具有重要意义。本研究将临床确诊为CDV病死犬的肠内容物处理液接种MDCK细胞,经传代培养后,通过电镜观察、间接免疫荧光检测、RT-PCR鉴定后确定分离获得了1株CDV,命名为CDVDN17-1。对分离毒株H基因的核苷酸序列分析结果显示,与HeB（09）3毒株H基因核苷酸同源性最高（99.8%）,与临床常用CDV疫苗株Rockborn同源性最高（96.1%）。H基因系统进化树分析结果显示,与HeB（09）3毒株亲缘关系最近,属于Asia-1型。用常规疫苗免疫犬血清与分离病毒进行中和试验,结果显示,当前疫苗毒株的免疫抗体对分离病毒有中和作用。根据对CDV-DN17-1 H基因序列分析,本研究克隆了H基因两段抗原区域片段,原核表达获得了两种重组蛋白rCDV-SDH1和rCDV-SDH2,并分别免疫实验兔制备了抗血清。血清中和试验结果显示,用rCDV-SDH1制备的血清抗体中和效价为1:35,高于rCDV-SDH2制备的血清抗体,因此选择rCDV-SDH1作为凝集试验的检测抗原。经偶联条件优化,将纯化的rCDV-SDH1与红色羧化聚苯乙烯纳米微球偶联,制备了致敏免疫彩色纳米微球。以致敏微球为凝集原,CDV阳性血清为凝集素,经特异性、敏感性和稳定性试验验证,建立了CDV抗体检测间接凝集试验。通过与商品化试剂盒对血清样品的检测结果对比分析,确定了间接凝集试验的阳性判定标准,即能使致敏微球发生凝集度为“++”的血清为阳性血清。该方法具有良好的特异性,只与CDV阳性血清发生凝集反应;试剂盒检测值S≥3的阳性血清,凝集试验结果均为阳性;4℃保存13个月的致敏微球与阴性、阳性血清的凝集结果无变化。初步对40份临床血清样品的检测结果显示,本研究建立的间接凝集试验与试剂盒的检测结果一致。本研究从感染CDV病死犬肠内容物中分离到1株CDV,初步分析了当前流行毒株H基因的变异情况,为疫苗的选择提供了参考;建立的CDV抗体检测间接凝集试验,操作简便,特异性良好,结果易于判定,不仅可以用于大量样品的集中检测,也可以针对宠物门诊单份血清样品随时检测,便于推广应用。
朱璐[5]（2018）在《稳定表达犬瘟热病毒SLAM受体细胞系的建立及犬瘟热病毒的分离与鉴定》文中研究说明犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起的一种在食肉目动物中广泛传播的急性,高传染性疾病,具有较高的发病率和死亡率。CDV野毒株很难在无受体的细胞系上进行传代,严重制约CDV的深入研究。本研究旨在构建稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,比较其对CDV野毒株的敏感性,并对分离到的CDV野毒株进行全基因组测序、构建系统进化树。本研究从以下几个方面开展:Ⅰ SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系建立本将真核表达载体Pcag-SLAM分别转染Vero细胞和BHK21细胞。经G418压力筛选结合有限稀释法筛选阳性克隆株,并通过RT-PCR、间接免疫荧光鉴定（IFA）和western blot等方法对稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系加以验证。结果显示本试验成功构建出SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系。Ⅱ CDV的分离及鉴定本研究探索了SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系对CDV的分离率,比较不同组织对同种细胞系的趋向性,对分离得到的CDV进行RT-PCR、IFA鉴定、电镜观察、动物回归实验。结果显示利用SLAM-Vero细胞从3只CDV阳性犬的肺和脾中分离得到2株CDV,而SLAM-BHK21细胞系,亲本Vero细胞及亲本BHK21细胞未能分离出病毒。Ⅲ CDV全基因组序列测序及系统发生分析对分离得到的CDV-SC1706株进行全基因组测序和系统发生分析,结果表明其核苷酸全长15690 bp。SC1706分离株的N基因系统分析显示该毒株与分离自辽宁的LN（10）1的同源性最高,达到99.6%,都属于亚洲1型野毒株。SC1706株与大熊猫分离株SX2014和Louguantai 1的同源性也分别达到了98.4%和98.3%,显示它们之间有很近的亲缘关系。与经典的onderstepoort疫苗株和shuskiy疫苗株的同源性很低,分别是有93.5%和93.1%。与CDV 3疫苗株的同源性最低,只有93%。SC1706株有9个潜在的N-糖基化位点,这一特点是野毒株特有的。
任丽[6]（2016）在《2014年中国麻疹的流行病学和四种麻疹病毒基因型H基因特征分析》文中研究表明目的对2014年全国麻疹报告确诊病例流行病学数据进行统计分析,了解全国麻疹流行病学特征,对2014年全国麻疹报告确诊病例进行空间分析,了解麻疹发病的空间分布特点及空间面积单元（省为基本单元）间疹发病的空间自相关关系和探索热点；分析2014年全国麻疹病毒野毒株基因型特征分布及分子流行病学特征；研究2013-2014年引起中国大陆4起麻疹暴发疫情的四种基因型（包括H1, B3, D8, D9）麻疹野毒株的血凝素蛋白（H）基因核苷酸和氨基酸变异特征,为预防控制本土和输入性麻疹疫情提供科学依据。方法分析中国2014年中国疾病预防控制中心信息系统麻疹监测信息报告管理系统的流行病学数据。ArcGis软件导入省基本单元的shp地理数据,属性表通过地理行政编码连接相关外部excel数据表,导入病例数,发病率等分析指标,再导出该图层所有要素；使用Geoda软件创建权重矩阵,利用单变量分析指标分析面积单元的的空间自相关关系。使用SatScan软件以市为地理单位,天为时间单位,进行时空扫描,探索热点区域。麻疹病原学常规监测数据分析方法,按照用于基因型鉴定的450bpN羧基末端模板目的片段,使用sequencher软件对测序的麻疹野毒株原始序列进行剪切。再用WHO推荐的26株A-G基因型毒株序列和Shanghai-191及4株中国H1基因型共31株作为参照株,再用Mega5.0软件对2014年全国31省分离到的麻疹毒株构建亲缘性关系树进行基因型鉴定和挑选2014年毒株库中具有时间和空间代表性的29株Hla基因亚型代表株及输入基因型（B3、D8、D9和G3）的N基因羧基末端450bp核苷酸序列进行同源性分析,了解全国麻疹毒株2014年分子流行病学特征。选择2013-2014年中国大陆本土麻疹病毒流行株H1基因型和三株输入性基因型麻疹病毒株D8,D9和B3各一株,提取核酸,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出H基因编码区全长基因片段（1854bp）,并对扩增出的产物进行序列测定和分析。以GenBank收录的H1四株,B3及D8各8株和D9两株及中国麻疹疫苗株沪191（S191）和长47（C 47）共25株H基因序列作为参照,构建亲缘性关系树和分析H基因核苷酸和氨基酸的遗传距离和变异特征。结果2014年全国麻疹报告病例数52637例,全国麻疹报告发病率3.88/10万,较2013年（27646例,发病率2.04/10万）上升明显,上升幅度90.4%。2014年麻疹成人病例构成比较往年上升,而小年龄组的（0-15岁）相应降低。2014年较2013年12省发病率降低,病例数减少,其中湖南省,安徽省,云南省发病率降低最明显,依次下降了4.28/10万,2.89/10万,2.11/10万；21省发病率上升,病例数增加,其中辽宁省,天津市,内蒙古自治区发病率上升最高,依次较13年上升了19.26/10万,16.35/10万,12.39/10万。②免疫史监测2014年全国麻疹麻疹确诊病例52637例,含麻疹成分疫苗接种史包括接种0剂,1剂,2剂,≥3剂,不详五种情况,病例数依次为25766例,3814例,1777例,21242例,有含麻疹成分疫苗明确接种史（包括1剂,2剂,≥3剂）5629例,占麻疹报告病例数10.1%。小年龄组（8月龄-岁）麻疹报告病例数20553,其中有含麻疹疫苗成分明确接种史的2693例,占该年龄组病例数的13.1%。面积单元空间自相关分析结果,2014年全国麻疹报告病例数与成人麻疹报告病例数全域Moran’I值及统计学检验P值分别为0.1493和0.0212及0.2853和0.000021,在α=0.5水平上具有统计学意义；而小于8月龄的婴儿全域Moran’s I值为0.1012,p值为0.5725,全国小于8月龄婴儿报告病例数在中国区域内无空间自相关性,但局域Moran’s I分析,辽宁省与临省间存在高-高空间自相性,而浙江省与临省存在低-低空间自相关。对全国所有病例报告发病率进行空间自相关分析,其结果为全域Moran’s I值为0.2848,P值为0.000069,报告发病率在全局上存在正相关关系。热点探索结果为,第一类聚集区在北京,天津,吉林、辽宁和内蒙古五省,其他西南地区和西北地区,湖南局部存在发病热点。麻疹病原学监测结果,2014年全国监测到麻疹毒株且有N羧基末端450bp核苷酸序列毒株4938株,其中Hla基因亚型4891株,占99.03%,10株B3基因型,3株D8,9株D9,和1株G3。北京市监测麻疹毒株1279株,其中Hla1271株,2株D8,1株B3,和5株VAC。从4891株H1a毒株中挑选了29株代表株进行同源性分析,基于N基因羧基末端450bp序列,结果显示,29株核苷酸序列同源性为96.1%-99.8%,核苷酸差异个数在1-18个,氨基酸同源性为99.0%-99.8,氨基酸差异为1～2个。29株序列同S191相比,核苷酸同源性89.2%-91.9%（36～48）,氨基酸同源性为98.5%-98.7%（2-3）。与Chin9322/H1a核苷酸同源性为97.3%-98.9%（5-12）,氨基酸同源性为99.2%-99.5%（1～2）；与Chin9475/H1b相比核苷酸同源性为95.1%-96.8%（14～22）,氨基酸同源性为98.8%-99.1%（2）。4株不同基因型野毒株与A基因型疫苗株H基因核苷酸和氨基酸同源性为94.2%-96.7%,95.4%-96.7%,氨基酸差异数为20-28,其中Beijingl4-1 （Hla）与A基因型疫苗株H基因同源性最低。Hla毒株与1993-1994年分离的毒株核苷酸同源性较高为97.7%-98.2%。 Beijingl4-1（H1a）和Shanghail4-1（B3）第240位点氨基酸位点由S→N,导致HA蛋白的1个N-糖基化位点丢失。结论2014年全国麻疹报告病例数及发病率较2013年增加明显,成人麻疹病例比例上升,小年龄组相对降低。需加强常规免疫接种及在高发病率地区加强麻疹强化免疫。2014年麻疹发病存在多个聚集区,华北,东北,西南,西北等地区。麻疹报告病例数、成人麻疹报告病例数及报告发病率在全局上具有正相关作用,小于8月龄婴儿报告病例数全局空间自相关性无统计学意义；局域空间自相关分析各项指标（总报告病例数,成人报告病例数和报告发病率）高-高空间自相关主要在河北省、辽宁省和吉林省,低-低空间自相关关系主要在浙江及四川省。4株野毒株与中国A基因型疫苗株H基因核苷酸和氨基酸同源性较高,且重要中和抗原位点未出现明显突变。A基因型疫苗株对我国流行的H1a亚型及B3、D8和D9输入性基因型野毒株感染仍具有保护作用。
王琦[7]（2016）在《小反刍兽疫病毒贵州株分离鉴定及相关基因序列分析》文中进行了进一步梳理小反刍兽疫（Peste des petits ruminants,PPR）是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、烈性传染病,本病传播快,发病率、死亡率高,严重危害小反刍兽养殖业的发展。自1942年首次在西非发现该病后,目前全球已有40多个国家报告发生该病。我国曾在西藏地区局部发生该病,但2014年以来PPR在多省爆发流行,贵州省的8个地区均被波及,造成了养殖业的巨大经济损失。为了解贵州省小反刍兽疫流行特征和病原分子特征,本文开展了本病快速检测方法、流行病学、病原分子特征研究,为了解PPR贵州流行特征、病原分子特征提供理论资料,为PPR的综合防控措施制定提供理论依据。1.小反刍兽疫RT-PCR检测方法的建立:基于PPRV N基因序列设计并合成特异性引物,以小反刍兽疫病毒疫苗株RNA样本为模板,建立小反刍兽疫一步法RT-PCR检测体系,通过性能评价评估所建立小反刍兽疫一步法RT-PCR检测方法的可靠性。结果显示,本研究所建立的一步法RT-PCR检测方法能扩增N基因大小为447bp片段,与预期大小相符;最佳退火温度为60℃;最佳模板终质量浓度为6.76×10-3g/L;最小PPRV RNA检出质量浓度为6.76×10-6g/L,该方法的特异性、敏感性良好,能用于小反刍兽疫临床样本的检测。基于PPRV P基因设计并合成特异性引物及探针,以小反刍兽疫病毒疫苗株RNA样本为模板制备标质粒准品,建立Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR检测方法反应体系及其标准曲线,并对所建立方法进行性能评价,确定所建Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的可靠性。结果显示,所建Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR检测方法能有效检测质粒标准品,形成典型的扩增曲线和标准曲线;对阳性标准品的最小检出浓度为1.7×102copies/μL,敏感性优于普通RT-PCR;组内重复试验和组间重复试验变异系数均低于2%,稳定性、特异性良好,能用于小反刍兽疫临床病例多种样本的检测和最佳检测样本的筛选。2.贵州省小反刍兽疫流行病学调查:收集贵州省毕节市、黔东南州、黔南州、铜仁市、六盘水市、遵义市、黔西南州、安顺市等8个市（州、县）养羊场的血清样本722份,疑似病例肺脏、淋巴结等组织样本122份,应用ELISA检测方法进行血清流行病学调查和RT-PCR方法进行病原流行病学调查,并基于N、H基因开展分子流行学调查。结果显示,未免疫羊群PPRV抗体阳性率平均达到26.3%（93/354）,全年多数月份均有PPRV隐性感染抗体阳性群体存在,其中3-5月份最高。免疫羊群平均抗体阳性率为59.0%（217/368）,羊群整体免疫情况不佳。来自于全省8个地区的样本均检测到PPRV核酸,平均阳性检出率为18.9%（23/122）。病例不同样本PPRV含毒量有所差异,其中肺脏样本可作为小反刍兽疫的最佳检测材料。N基因全长为1578bp,共编码525个氨基酸,来自贵州省8个地区PPRV流行株N基因同源性为92.2%～100%,与国内分离株同源性达到97.7%～99.6%,与国外分离株同源性介于88.5%～97.6%之间。N基因推导氨基酸序列变异主要集中在IV区（421～525的羧基末端区）;而H基因全长为1830bp,共编码609个氨基酸,来自贵州省8个地区PPRV流行株H基因同源性为88.9%～99.8%,与中国分离株同源性达到97.5%～99.8%,与国外分离株H基因同源性介于89.0%～98.2%之间。H基因推导氨基酸序列与其他毒株比较存在点突变,其中最为突出的是203位由亮氨酸（L）突变成甲硫氨酸（M）,315位由赖氨酸K突变成精氨酸（R）,450位由精氨酸（R）突变成赖氨酸（K）,546位由甘氨酸（G）突变成丝氨酸（S）。PPRV N、H基因遗传进行分析显示,PPRV贵州流行株与国内分离株在同一分支,属于第Ⅳ支系,不同于疫苗株Nigeria-75-1株所在的第Ⅰ支系。上述研究结果表明,PPR在贵州省范围内流行区域广,其中3-5月份高发。PRRV贵州流行株具有区域特征和一定的变异。3.小反刍兽疫病毒贵州流行株分离鉴定:取PPR阳性病例肺脏和淋巴结等样本,经处理后接种Vero细胞并盲传,并采用形态学观察、病原核酸检测、间接免疫荧光试验及电镜试验等方法对分离病毒进行鉴定。结果显示,阳性病料样本接种Vero细胞并盲传,能引起Vero细胞出现细胞病变,初期细胞间隙变大,部分细胞堆积成团,随后细胞开始变圆、收缩,并逐渐出现部分细胞溶解。RT-PCR鉴定显示,病毒细胞培养物第一代至第五代存在差异,从第六代开始逐渐稳定,均能检测到病毒核酸的存在。间接免疫荧光试验检测显示,细胞培养物中特异性的绿色荧光,反映出细胞中病毒抗原的存在。病毒细胞培养物经超薄切片后在透射电子显微镜下能观察到胞浆中电子致密的PPRV颗粒存在。上述实验结果表明,从临床阳性病例组织样本中分离到了PPRV,2株病毒分别命名为PPRV-GZPX株和PPRV-GZSY株。4.小反刍兽疫病毒贵州流行株基因序列分析:以两株PPRV贵州分离株为研究对象,针对PPRV全基因组设计7对引物,RT-PCR分别扩增针对PPRV全基因组的7个基因片段,经克隆测序后,用生物信息学软件进行拼接和序列分析。结果显示,PPRV贵州株全长15954bp,2株贵州分离株同源性为99.7%,与疫苗株Nigeria75-1株的同源性为92.1%。与国内分离株的全基因核苷酸序列达到了97.2%～99.7%。与国外分离株全基因同源性介于88.1%～97.1%之间。PPRV基因组全长15954bp,RNA链从3’至5’依次是N-P（C/V）-M-F-H-L 6个基因,共编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素（H）、大蛋白（L）6种结构蛋白和2种非结构蛋白（C/V）,各蛋白氨基酸序列均存在不同程度的变异,其中H基因变异最为明显。系统进化分析结果显示,贵州株与国内近年分离株处于同一分支内,均属于PPRVⅣ系,不同于疫苗株所处的Ⅰ系和非洲为代表的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系。上述研究结果表明,PPRV全基因组长度稳定,但在局部存在明显的变异和点突变。PRRV贵州分离株与国内分离株关系近,多因国内引种存在相关性;与疫苗株存在明显差异,处于不同支系,在疫苗选择中应考虑毒株分子变化情况。
闫飞虎[8]（2016）在《PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究》文中进行了进一步梳理小反刍兽疫（peste des petits ruminants,PPR）俗称羊瘟,又被称为小反刍兽假性牛瘟,是一种由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）引起的急性或亚急性传染病。世界动物卫生组织（The World Organization for Animal Health,OIE）将其列为必须通报疫病,我国将其列为一类动物疫病。2007年7月在我国西藏阿里地区出现了中国首例小反刍兽疫,2014年我国大面积爆发小反刍兽疫,波及20余省份,给当地养羊业造成巨大经济损失。此外,小反刍兽疫经空气传播,最易感的是小反刍动物,尤其野生小反刍动物不受国界限制,很容易造成全球性蔓延,所以有效的预防显得尤为重要。弱毒疫苗是OIE规定的唯一允许使用的小反刍兽疫病毒疫苗,然而PPRV对热非常敏感,疫苗在保护和运输过程中保持冷链状态相对较为困难。此外,减毒活疫苗还存在毒力返强的风险,这就限制了PPR弱毒疫苗的大规模田间使用,因此迫切需要开发一种安全有效、热稳定性好的疫苗候选。相比弱毒疫苗与灭活疫苗,病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）疫苗成为安全稳定的疫苗候选者之一,病毒样颗粒是由病毒一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒。在形态上,VLPs类似于真实的病毒粒子,但是由于缺乏具有感染性的核酸,故无复制和感染能力。虽然病毒样颗粒不具有感染性,但VLPs具有类似于天然病毒的理化性质,能被抗原提呈细胞摄取加工提呈,激发细胞免疫反应和体液免疫应答,具有安全性高和免疫原性好的优点。流感VLPs疫苗、乙型肝炎VLPs疫苗及猪圆环病毒2型VLPs疫苗都已进入临床试验或者已被比准上市。但目前为止,有关小反刍兽疫病毒病毒样颗粒（PPRV VLPs）构建研究的报道较少。因此,本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统构建生产不同毒株的PPRV VLPs,并对其免疫原性进行研究比较,选取免疫原性好的毒株的病毒样颗粒进行本动物免疫,为开发安全、有效的小反刍兽疫病毒样颗粒候选疫苗奠定基础。第1章:小反刍兽疫M、F和H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备本研究以PPRV疫苗株Nigeria 75/1株为研究对象,分别针对其M、F和H蛋白的主要抗原表位区设计克隆引物,通过RT-PCR扩增去除跨膜区和信号肽序列而保留主要抗原表位区片段,将编码序列大小分别为1005 bp PPRV M基因片段克隆至原核表达载体p ET-30a（+）中,将编码序列大小分别为1653 bp和1245 bp的PPRV F、H基因片段分别克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组质粒p ET-30a（+）-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H。将各表达质粒转化宿主菌Transetta（DE3）,表达条件经优化后最终确定为0.4m M IPTG和37℃条件下诱导表达4h,经SDS-PAGE分析结果显示重组质粒p ET-30a（+）-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H在大肠埃希菌中分别诱导表达出分子质量为61 k D、66 k D和60 k D的重组蛋白,大小与预期相符,主要以不溶性包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示M、F、H重组蛋白均能被绵阳抗PPRV多克隆抗体特异性识别。以经Ni-NTA亲和层析纯化后的M、F和H重组蛋白分别免疫昆明鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV M、F和H蛋白多克隆抗体,为后期鉴定重组杆状病毒奠定了基础。第2章:小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F和rp FB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光（IFA）鉴定,可见特异性荧光;以三种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。电镜下可以到80-100nm左右的病毒样粒子,且表面纤突明显。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D和68k D左右的条带,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。第3章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株（Gen Bank Access No.FJ905304.1）M、F、H和N基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F、rp FB-2H和rp FB-2N。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光（IFA）鉴定,可见特异性荧光;以四种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D,68k D和58k D左右的条带,表明基质膜蛋白、核衣壳蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠和山羊可诱导产生保护性中和抗体。免疫VLPs的小鼠触发显着增多的分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T细胞;免疫PPRV弱毒的小鼠触发显着增多的分泌IL-4的CD4+T和CD8+T细胞;VLPs诱导产生强大的特异性Ig G2a抗体反应,倾向于Th1型免疫应答;与之相反,PPRV诱导产生更多的Ig G1抗体反应,倾向于Th2型免疫应答;VLPs促进B细胞和DC募集和/或活化,T淋巴细胞增殖和活化,因此,PPRV VLPs具有开发成为安全有效的新型动物疫苗的潜能。第4章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒在High5细胞中的高效表达及其免疫原性研究以期利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统比较病毒样颗粒在High5细胞和Sf9细胞中的表达量,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株（Gen Bank Access No.FJ905304.1）M、F和H基因,构建了含有目的基因的重组杆状病毒rp FB-M-F-H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光（IFA）鉴定,都可见特异性荧光,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白在两种细胞中得到表达;间接免疫荧光试验、Western blot检测及血凝试验试验结果总体表明High5细胞更能高效的包装病毒样颗粒,产量要高于Sf9细胞。以重组杆状病毒感染昆虫High5细胞和Sf9细胞组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。后期将High5细胞生产的病毒样颗粒免疫小鼠和可诱导产生保护性中和抗体和细胞免疫。
许松涛[9]（2015）在《我国本土H1基因型麻疹野病毒中和抗原基因和抗原位点变异变迁研究》文中提出麻疹是一种由麻疹病毒引起的以发热、出疹为特征的病毒性传染病,传染性极强,虽然是一种疫苗可预防疾病,但一直以来仍严重威胁全世界范围内的婴幼儿健康。麻疹病毒为副粘病毒科,麻疹病毒属,人是唯一宿主,基因组为单股负链RNA,只有一个血清型,但有多个基因型,目前全球共发现24个基因型,1993年发现流行在我国的麻疹野病毒为H1基因型,通过连续20年的病毒学监测发现H1基因型为我国本土绝对优势基因型,是目前发现的唯一一个基因型在一个国家作为绝对优势基因型持续流行了 20年。了解病毒的遗传进化规律是预防控制疾病的关键,因此本研究旨在揭露在我国本土持续流行的H1基因型麻疹野病毒两个重要中和抗原基因的变异变迁规律及特征;此外,结合目前我国部分地区麻疹发病年龄特征改变的现象（麻疹母传抗体滴度的降低导致小于8月龄的病例明显增多；初免失败、继发性免疫失败或免疫持久性下降等导致的成人病例明显增多的现象）,评估我国现用疫苗对H1基因型麻疹野病毒的保护效果。本研究从近20年来本室保存的H1基因型麻疹野病毒毒株库中依据年代、地域及N基因C末端亲缘性关系树选取了 86株代表株,采用病毒分离、RT-PCR、序列测定及生物信息学分析麻疹病毒两个中和抗原（血凝素H和血溶素F）基因的变异变迁规律,阐述病毒的起源、进化、遗传多态性、亲缘性关系以及基于血凝素（HA）蛋白的晶体结构分析了重要功能位点（受体结合位点和抗原决定簇位点）的稳定性等。结果显示基于N、H和F 3个基因构建的亲缘性关系树拓扑结构一致,H1基因型分为H1a、H1b和H1c,H1c从1994年起未再发现,H1b从2000年起未再发现,H1a为持续流行分支,亲缘性关系分析显示近年来在我国流行的麻疹野病毒无明显流行规律,同一、多个麻疹野病毒在不同省内、省间引起循环和共循环;选择压力分析显示H、F基因为负选择压力,无累计突变现象,说明我国本土麻疹野病毒在免疫压力不断积累情况下未发生抗原漂移:氨基酸核苷酸同源性分析结果显示,H1基因型H和F基因与其它23个基因型麻疹野病毒相比,与我国疫苗株差异最大,H和F基因与我国疫苗株（S191和C47）相比分别有15和13个氨基酸变异,其中H基因的2个（211aa和303aa）是抗原决定簇位点,1个（48 1aa ）为CD46受体结合位点,60株H1基因型麻疹病毒中发现10个高变异氨基酸（保守率<90%）;核苷酸进化速率显示H、N和F基因分别为0.75×10-3/核苷酸/年、1.65X10-3/核苷酸/年、1.07×10-3/核苷酸/年;51株麻疹野病毒的H基因第238位氨基酸突变导致H蛋白第五个糖基化位点的消失;病毒起源分析结果显示H1基因型麻疹野病毒的起源时间约在1985年;病毒多态性分析结果显示从2000年到2005年病毒多态性逐渐增加,而从2005年到2012年麻疹野病毒多态性逐渐下降,与此期间麻疹发病数趋势基本吻合;基于HA蛋白3D结构的抗原稳定性分析结果显示已报道的3个麻疹病毒受体结合位点和抗原决定簇位点都位于蛋白的外侧并保守（除CD46受体结合位点481aa和先前描述的两个抗原决定簇位点发生变异）,其它变异位点并非已证实的重要功能位点。本研究初步阐明了在我国持续流行至少20年的H1基因型麻疹野病毒两个重要中和抗原的变异变迁规律,分析了本土 H1基因型麻疹野毒的起源、进化、病毒多态性变化规律,同时也首次采用HA蛋白的晶体结构对H1基因型麻疹野病毒的抗原动态稳定性进行分析。结果提示H1基因型麻疹野病毒中和抗原基因较保守,无累计突变及抗原飘逸现象,仍能有效感染人类;我国现用疫苗仍能保护麻疹病毒的感染,但疫苗的免疫效率及免疫持久性很可能因中和抗原上氨基酸的变异而变化,因此对疫苗免疫效率的进一步评估迫在眉睫。
刘玉秀[10]（2014）在《犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究》文中认为犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）感染引起食肉科动物死亡的急性、高度接触性传染病。近年来，随着全球环境变化、动物栖息地的人为频繁干预及病毒的进化，CDV的自然宿主已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩大到猫科、灵猫科等所有陆地食肉科动物，此外也有偶蹄目、海豹和非人灵长类自然感染CDV的报道。CDV给全球动物养殖业和生物多样性带来极大损失和危害的同时，其社会公共危害性越来越受到人们重视。传代细胞系上缺少CDV病毒受体，人工分离培养病毒十分困难，导致人们对病毒的病原学与免疫研究认知较其它病毒而言发展相对缓慢，特别是在免疫预防方面一直沿用上世纪50年代研制的CDV。因此，当前构建高效分离CDV的敏感细胞系，建立病毒的反向遗传操作平台，分离研究当前流行犬瘟热野毒株的特性，分析野毒株与商业疫苗毒株抗原蛋白分子特性及抗原蛋白差异，开展有效安全成本低廉犬用疫苗或佐剂的研制具有重大意义，对预防控制国内犬瘟热疫情蔓延具有重要现实意义。I表达犬瘟热病毒SLAM受体的敏感细胞系构建及其病毒的分离与鉴定鉴于传统的CDV分离培养方法有分离率低、耗时长、成本高等缺陷，因此尽快建立方便、快捷分离培养CDV的方法显得尤为重要。本试验成功构建了表达犬瘟热病毒受体SLAM的Vero/DogSLAM细胞系，并用该细胞系分离到猴源（Monkey-BJ01-DV）和犬源（SC-CDV）CDV野毒各一株，探索了不同动物来源CDV对不同种属动物SLAM利用情况，比较了同时期猴源和犬源流行犬瘟热毒株的重要蛋白基因序列。结果显示本试验构建的Vero/DogSLAM敏感细胞系在接种病料36-48h后就能出现典型CPE，缩短病毒分离时间，提高CDV分离率，将有力地推动对犬瘟热病毒分子特征的研究。此外，我们还比较了不同种属来源CDV受体病毒病毒分离的敏感性，研究发现猴源和犬源CDV都能高效利用猴和犬SLAM受体，但是猴源CDV更倾向于利用猴SLAM，犬源CDV对犬SLAM亲和力比对猴SLAM高；Monkey-BJ01-DV病毒H蛋白基因与国内同期流行的犬源和狐狸源CDV病毒的同源性最高达98.4％；且与同期流行食肉科源CDV相比，三株猴源CDV-H蛋白有E276V、Q392R、D435Y和I542F4个特异性突变位点。II现行不同疫苗株犬瘟热病毒免疫效果评价及其H蛋白基因特性分析研究虽然减毒活疫苗早已用于犬瘟热的防控，近年来国内家养动物和养殖场的犬科、鼬属经济动物经常暴发犬瘟热疫情。有学者认为是目前疫苗所用毒株与流行野毒株抗原性有所差异，野毒株能逃避现行所用疫苗产生的免疫保护而致病。本实验为了解目前常用犬用疫苗中CDV毒株与国内流行野毒株H基因的差异性，对分别来自法国、俄罗斯、荷兰、韩国及国产的5种犬用疫苗在犬和狐狸上对以上疫苗进行了免疫效果评价；同时对其CDV-H基因进行序列测定，与传统疫苗株和国内野毒株的H基因进行比较。结果显示证实韩国疫苗使用毒株的免疫原性最好。法国疫苗使用Onderstepoort株；荷兰疫苗使用Vaccine strain JP株；国产疫苗使用的毒株与Snyder Hill同源性最高；俄罗斯疫苗使用的毒株也同属于北美疫苗株，但是于传统的疫苗株亲缘性低，自成一个分支；韩国疫苗使用毒株与野毒株同源性最高。序列分析表明国内流行野毒株与现行使用疫苗毒株H蛋白的同源性只有87－90％，疫苗株H蛋白一般有4－7个糖基化位点，而国内流行野毒株已经进化出9个糖基化位点。韩国疫苗使用毒株H蛋白含有野生株特有的g3（309）糖基化位点。H基因序列的多样性可能对不同毒株H蛋白的中和表位产生重要的影响。为近一步明确犬瘟热病毒强毒株与弱毒株间的抗原性差异，我们分析了决定CDV病毒抗原性的H糖蛋白。本试验利用2株对疫苗株和野生株H蛋白表现不同亲和力的单抗：d-7和JD-7，通过点突变和基因重组方法探索野生株和疫苗株H蛋白抗原性差异位点。最后通过Phyre2软件构建了CDV-H蛋白3D结构模型，比较分析了疫苗株和野生株H蛋白空间结构，发现H蛋白的234－246aa、302－313aa及415-418aa之间野生株和疫苗株存在3处空间构象差异域，初步推断这三处差异导致疫苗株和野生株抗原性差异区域。本试验揭示国内常用疫苗毒株背景，发现其与国内流行野毒株H蛋白同源性较低，对今后CD防治措施制定提供一定指导作用，及对今后犬用疫苗毒株筛选工作提供一定的借鉴意义。III表达IL-18重组犬瘟热病毒感染性克隆构建与初步应用研究犬瘟热疫苗株和野毒株之间抗原性差异，使进化野毒株可能逃避疫苗株产生的免疫保护。因此有必要在增强犬用疫苗刺激机体产生更多细胞免疫反应着手拓展开发新型犬用疫苗或佐剂研究。白细胞介素18（Interleukin-18, IL-18）在诱导机体TH1型细胞产生IFN-γ对抗胞内寄生虫、细菌和病毒感染及抗肿瘤生长中具有重要作用，其作为一种疫苗佐剂或抗癌制剂被广泛研究应用。但IL-18缺乏自身信号肽，借助Caspases-1裂解形成成熟性IL-18发挥其生物学功能。研究显示粘附犬IL-12p40信号肽（cIL12ss）的成熟型IL-18能非依赖caspases-1裂解形成成熟型IL-18。本试验中构建了粘附人IL-2信号肽（hIL2ss）的犬IL-18表达系统，研究发现该表达系统也能非依赖caspases-1裂解形成成熟型犬IL-18，且粘附hIL2ss表达系统表达的IL-18刺激犬免疫细胞分泌IFN-γ量为863pg/ml，而cIL-12ss表达系统为424pg/ml，说明本试验构建IL-18表达系统更成功有效。随后我们构建了粘附hIL2ss的犬/鼠IL-18的重组犬瘟热病毒感染性克隆，成功拯救2株重组病毒rCDV-hIL2ss-cIL18和rCDV-hIL2ss-mIL18。结果显示rCDV-hIL2ss-cIL18感染细胞中即能检测到IL-18前体proIL-18（22kDa）蛋白又能检测到成熟型IL-18（18kDa），而rCDV-hIL2ss-mIL18感染细胞中只能检测到成熟型IL-18。这2株重组病毒保持与母本病毒相似的生长动力学特性；重组病毒感染细胞后能向细胞上清释放有生物学活性的IL-18，能刺激犬或鼠免疫细胞分泌IFN-γ。本实验构建的表达IL-18重组犬瘟热病毒可能是一种新的犬或鼠用疫苗佐剂和抗癌候选制剂。
二、用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白(H)基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白(H)基因（论文提纲范文）
（1）基于小反刍兽疫病毒H蛋白的间接ELISA方法建立及晶体培养（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 小反刍兽疫概述 |
| 1.1.1 小反刍兽疫流行情况 |
| 1.1.2 小反刍兽疫危害 |
| 1.1.3 小反刍兽疫研究方向展望 |
| 1.2 小反刍兽疫病毒概述 |
| 1.2.1 PPRV基因组 |
| 1.2.2 PPRV理化特性和生物学特性 |
| 1.2.3 PPRV结构蛋白及其功能 |
| 1.2.4 PPRV病毒复制与免疫机制 |
| 1.2.5 小反刍兽疫病毒检测方法 |
| 1.2.6 小反刍兽疫疫苗 |
| 1.2.7 小反刍兽疫疫病防控措施 |
| 1.3 蛋白表达系统 |
| 1.3.1 原核表达系统 |
| 1.3.2 真核表达系统 |
| 1.3.3 新型蛋白表达技术 |
| 1.4 蛋白晶体 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 小反刍兽疫病毒H蛋白的表达与纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株、酶及质粒 |
| 2.2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.2.3 主要溶液配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 PPRV-H蛋白基因的设计与合成 |
| 2.3.2 pGAPZα-PPRV-H重组质粒的构建 |
| 2.3.3 pGAPZα-PPRV-H重组质粒的表达 |
| 2.3.4 pGAPZα-PPRV-H蛋白的纯化 |
| 2.3.5 pGAPZα-PPRV-H蛋白的SDS-PAGE鉴定分析 |
| 2.3.6 pGAPZα-PPRV-H蛋白的Western Blot鉴定 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 PPRV-H基因分析 |
| 2.4.2 pGAPZα-PPRV-H重组质粒的构建 |
| 2.4.3 pGAPZα-PPRV-H重组质粒的表达 |
| 2.4.4 pGAPZα-PPRV-H蛋白的Western Blot鉴定 |
| 2.4.5 pGAPZα-PPRV-H蛋白纯化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 小反刍兽疫病毒H蛋白晶体培养 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 主要试剂与耗材 |
| 3.2.2 主要溶液配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 生物信息学分析 |
| 3.3.2 分子筛层析纯化 |
| 3.3.3 蛋白结晶 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 生物学信息分析 |
| 3.4.2 分子筛层析纯化 |
| 3.4.3 蛋白结晶条件的筛选 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 基于H蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 主要试剂与耗材 |
| 4.2.2 主要溶液及配制 |
| 4.2.3 仪器和设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 间接ELISA方法的建立 |
| 4.3.2 封闭液、血清稀释液以及兔抗羊IgG-HRP稀释液的确定 |
| 4.3.3 最佳抗原包被浓度及血清最佳浓度的确定 |
| 4.3.4 最佳兔抗羊IgG-HRP工作浓度的确定 |
| 4.3.5 最佳作用时间的确定 |
| 4.3.6 阴阳性临界值的确定 |
| 4.3.7 特异性试验 |
| 4.3.8 敏感性试验 |
| 4.3.9 重复性试验 |
| 4.3.10 临床样本检测 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 封闭液、血清稀释液以及酶标二抗稀释液的确定 |
| 4.4.2 最佳抗原包被浓度及最佳血清稀释度的确定 |
| 4.4.3 最佳酶标二抗工作浓度的确定 |
| 4.4.4 最佳工作时间的确定 |
| 4.4.5 阴阳性临界值的确定 |
| 4.4.6 特异性分析 |
| 4.4.7 敏感性分析 |
| 4.4.8 重复性分析 |
| 4.4.9 临床样本检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 |
| 5.2 |
| 5.3 |
| 第六章 创新点及展望 |
| 6.1 创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）犬瘟热病毒对人SLAM受体适应机制及其在人SLAM转基因小鼠体内复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 犬瘟热病毒研究进展 |
| 1.1 犬瘟热概述 |
| 1.1.1 CDV的病原学 |
| 1.1.2 犬瘟热流行病学 |
| 1.1.3 犬瘟热的临床症状与病理变化 |
| 1.2 犬瘟热病毒的基因组结构和功能 |
| 1.2.1 CDV形态结构 |
| 1.2.2 CDV基因组结构 |
| 1.2.3 CDV蛋白及其主要功能 |
| 1.3 犬瘟热病毒致病机理 |
| 1.3.1 信号淋巴细胞激活分子 |
| 1.3.2 脊髓灰质炎病毒受体相关分子4 |
| 1.3.3 其他受体 |
| 1.3.4 SLAM介导CDV入侵淋巴细胞 |
| 1.3.5 Nectin-4 介导CDV入侵上皮组织 |
| 1.4 犬瘟热病毒基因变异与跨宿主传播 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 犬瘟热病毒5804Pe/H株适应人SLAM受体的机制研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养与病毒增殖 |
| 2.2.2 hSLAM抗体阻断试验 |
| 2.2.3 CDV H与hSLAM蛋白同源建模与蛋白对接分析 |
| 2.2.4 Western blot检测H蛋白表达量 |
| 2.2.5 免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白相互作用 |
| 2.2.6 人外周血单个核细胞（PBMC）分离与培养 |
| 2.2.7 CDV体外感染人PBMC |
| 2.2.8 抗体交叉中和试验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒滴度测定结果 |
| 2.3.2 hSLAM抗体阻断试验结果 |
| 2.3.3 CDV H与 hSLAM相互作用三维结构预测结果 |
| 2.3.4 Co-IP检测CDV H与hSLAM受体之间的相互作用结果 |
| 2.3.5 D540G突变对CDV H蛋白表达量的影响 |
| 2.3.6 D540G突变对CDV H蛋白膜表达量的影响 |
| 2.3.7 CDV体外感染人PBMC结果 |
| 2.3.8 抗体交叉中和试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 犬瘟热病毒在hSLAM受体转基因小鼠中复制的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 动物、细胞和病毒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 hSLAM转基因小鼠攻毒 |
| 3.2.2 小鼠组织与PBMC病毒RNA的提取 |
| 3.2.3 小鼠组织中病毒RNA差异表达检测 |
| 3.2.4 小鼠组织中病毒载量测定 |
| 3.2.5 CDV与hSLAM受体体内组织共定位 |
| 3.2.6 数据统计与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 CDV感染hSLAM转基因小鼠结果 |
| 3.3.2 CDV核酸在hSLAM转基因小鼠组织中检测结果 |
| 3.3.3 CDV感染hSLAM转基因小鼠不同组织中病毒载量结果 |
| 3.3.4 CDV感染小鼠病毒与hSLAM共定位结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 犬瘟热研究进展 |
| 1.1 犬瘟热病毒病原学特性 |
| 1.2 CDV基因组结构与功能 |
| 1.2.1 核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein, N) |
| 1.2.2 磷蛋白(Phosphoprotein, P) |
| 1.2.3 基质蛋白(Matrix protein, M) |
| 1.2.4 大蛋白(Large polymerase protein, L) |
| 1.2.5 融合蛋白(Fusion protein, F) |
| 1.2.6 血凝素蛋白(Hemagglutinin protein, H) |
| 1.2.7 非结构蛋白(V/C) |
| 1.3 国内外犬瘟热流行病学 |
| 1.4 犬瘟热诊断方法的研究进展 |
| 1.4.1 犬瘟热血清学检测方法 |
| 1.4.2 犬瘟热分子生物学检测方法 |
| 第二章 江苏部分地区犬瘟热病毒分子流行病学调查 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞及病料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 引物设计 |
| 2.1.5 RT-PCR鉴定 |
| 2.1.6 分离毒株H基因片段的扩增与分析 |
| 2.2 .结果 |
| 2.2.1 病料的RT-PCR鉴定 |
| 2.2.2 全长H基因片段的扩增 |
| 2.2.3 H基因遗传变异分析 |
| 2.2.4 H基因序列分析 |
| 2.2.5 H基因同源性比对分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要实验材料及实验动物 |
| 3.1.2 病毒的培养与纯化 |
| 3.1.3 截短H基因的扩增与原核表达 |
| 3.1.4 动物免疫与杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.1.5 单克隆抗体的特异性检测 |
| 3.1.6 腹水的制备、抗体亚类与中和活性分析 |
| 3.1.7 单克隆抗体抗原识别位点的差异性分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 截短H片段的克隆及重组蛋白的制备 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞株的筛选及其特异性检测 |
| 3.2.3 单克隆抗体的生物学特性 |
| 3.2.4 单克隆抗体抗原识别位点的差异性分析 |
| 3.2.5 单克隆抗体稳定性分析 |
| 3.2.6 广谱病毒中和活性检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 犬瘟热病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 抗体、质粒及实验动物 |
| 4.1.2 血清和样品 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 重组蛋白的表达及纯化 |
| 4.1.6 单克隆抗体的纯化及其HRP标记 |
| 4.1.7 抗原包被浓度和酶标抗体稀释度的确定 |
| 4.1.8 待检血清最佳稀释度的确定 |
| 4.1.9 包被条件的优化 |
| 4.1.10 最佳封闭液浓度和封闭时间的确定 |
| 4.1.11 酶标抗体最佳工作时间的确定 |
| 4.1.12 临界值的确定 |
| 4.1.13 特异性试验 |
| 4.1.14 敏感性试验 |
| 4.1.15 重复性试验 |
| 4.1.16 符合率试验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 单克隆抗体的纯化 |
| 4.2.2 抗原包被浓度和酶标抗体稀释度的确定 |
| 4.2.3 血清最佳稀释度的确定 |
| 4.2.4 包被条件的确定 |
| 4.2.5 最佳封闭液浓度和封闭时间的确定 |
| 4.2.6 酶标抗体最佳工作时间的确定 |
| 4.2.7 临界值的确定 |
| 4.2.8 特异性试验 |
| 4.2.9 敏感性试验 |
| 4.2.10 重复性试验 |
| 4.2.11 符合率试验 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 犬瘟热病毒抗原竞争 ELISA 检测方法的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、病毒及实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 重组蛋白的纯化及其HRP标记 |
| 5.1.5 单克隆抗体的纯化 |
| 5.1.6 抗体包被浓度和酶标抗原稀释度的确定 |
| 5.1.7 包被条件的优化 |
| 5.1.8 最佳封闭液浓度和封闭时间的确定 |
| 5.1.9 酶标抗原最佳工作时间的确定 |
| 5.1.10 临界值的确定 |
| 5.1.11 特异性试验 |
| 5.1.12 敏感性试验 |
| 5.1.13 重复性试验 |
| 5.1.14 符合率试验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 抗体包被浓度和酶标抗原稀释度的确定 |
| 5.2.2 包被条件的确定 |
| 5.2.3 最佳封闭液浓度和封闭时间的确定 |
| 5.2.4 酶标抗原最佳工作时间的确定 |
| 5.2.5 临界值的确定 |
| 5.2.6 特异性试验 |
| 5.2.7 敏感性试验 |
| 5.2.8 重复性试验 |
| 5.2.9 符合率试验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）犬瘟热病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 犬瘟热和犬瘟热病毒概述 |
| 1.1.1 犬瘟热 |
| 1.1.2 犬瘟热病毒形态和理化特性 |
| 1.1.3 犬瘟热病毒分类及其基因组结构 |
| 1.1.4 犬瘟热病毒的分离培养 |
| 1.1.5 犬瘟热病毒的鉴定 |
| 1.2 犬瘟热的防治 |
| 1.2.1 犬瘟热疫苗免疫接种 |
| 1.2.2 犬瘟热临床治疗 |
| 1.3 犬瘟热疫苗免疫抗体的检测方法 |
| 1.3.1 血清中和试验(SN) |
| 1.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4 凝集试验 |
| 1.4.1 直接凝集试验 |
| 1.4.2 间接凝集试验 |
| 1.5 纳米微球在疾病检测领域的应用 |
| 1.5.1 纳米微球的种类 |
| 1.5.2 纳米微球在疾病检测领域的应用 |
| 1.5.3 纳米微球致敏技术 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌毒株、质粒、实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂、培养基和耗材 |
| 2.1.3 病料和血清 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 犬瘟热病毒的分离鉴定 |
| 2.2.2 犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析 |
| 2.2.3 犬瘟热疫苗免疫犬血清抗体检测 |
| 2.2.4 重组CDVH蛋白的表达 |
| 2.2.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.6 重组蛋白的Western-blot鉴定 |
| 2.2.7 重组蛋白免疫原性比较 |
| 2.2.8 CDV抗体检测间接凝集试验的建立 |
| 2.2.9 CDV抗体检测间接凝集试验的初步应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 CDV分离鉴定 |
| 3.1.1 细胞病变 |
| 3.1.2 电镜观察 |
| 3.1.3 RT-PCR鉴定 |
| 3.1.4 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2 CDVH基因克隆及序列分析 |
| 3.2.1 CDVH基因的扩增 |
| 3.2.2 CDVH基因核苷酸序列分析 |
| 3.2.3 CDVH基因氨基酸的序列分析 |
| 3.2.4 H蛋白的糖基化位点预测 |
| 3.2.5 分离毒株与疫苗毒株H蛋白抗原表位分析 |
| 3.3 CDV疫苗免疫犬血清抗体检测 |
| 3.3.1 CDVTCID_(50)测定 |
| 3.3.2 免疫犬血清中和试验 |
| 3.3.3 商品试剂盒检测犬血清抗体 |
| 3.4 重组CDVH蛋白的表达 |
| 3.4.1 CDVH基因的分段克隆 |
| 3.4.2 重组菌的构建 |
| 3.4.3 重组蛋白的表达 |
| 3.5 重组蛋白的纯化和免疫原性鉴定 |
| 3.5.1 重组蛋白的纯化 |
| 3.5.2 Western-blot免疫原性鉴定 |
| 3.6 重组蛋白免疫原性比较 |
| 3.6.1 免疫抗体检测 |
| 3.6.2 细胞中和试验 |
| 3.7 CDV抗体检测间接凝集试验的建立 |
| 3.7.1 聚苯乙烯微球致敏条件优化 |
| 3.7.2 CDV抗体检测间接凝集试验阳性标准确立 |
| 3.7.3 凝集反应的特异性和敏感性试验 |
| 3.7.4 凝集反应的重复性和稳定性试验 |
| 3.7.5 犬瘟热病毒抗体检测间接凝集试验的初步应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 犬瘟热病毒分离病料选取 |
| 4.2 犬瘟热病毒的细胞分离培养 |
| 4.3 犬瘟热毒株的遗传变异 |
| 4.4 用于致敏纳米微球的重组蛋白的选择 |
| 4.5 间接凝集试验检测犬血清抗体的应用前景 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）稳定表达犬瘟热病毒SLAM受体细胞系的建立及犬瘟热病毒的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词汇及其符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 CDV概述 |
| 2 CD的流行病学 |
| 2.1 CDV的传播和稳定性 |
| 2.2 CD的宿主范围和流行性 |
| 3 CD的临床症状 |
| 4 CD发病机理 |
| 5 CDV主要蛋白功能 |
| 6 CDV的受体研究进展 |
| 6.1 SLAM(CD150) |
| 6.2 nectin-4受体 |
| 7 CDV的分离培养 |
| 8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 建立SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒和试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 pcag-HA-Neo-Igk-HA载体构建 |
| 2.3 pcag-SLAM真核表达载体构建 |
| 2.4 Vero细胞和BHK21细胞G418耐受性试验 |
| 2.5 pcag-SLAM真核表达载体转染进Vero细胞和BHK21细胞 |
| 2.6 RT-PCR初步鉴定SLAM基因的表达 |
| 2.7 筛选细胞 |
| 2.8 鉴定细胞系 |
| 3 结果 |
| 3.1 克隆SV40-Neo基因和Igk-HA基因 |
| 3.2 构建pcag-SLAM真核表达载体 |
| 3.3 确定G418筛选浓度 |
| 3.4 间接免疫荧光(IFA)鉴定细胞转染 |
| 3.5 Westernblot法鉴定SLAM基因融合蛋白表达情况 |
| 3.6 细胞稳定性分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 犬瘟热病毒的分离及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 分离病毒材料预处理 |
| 2.2 阳性犬病料处理 |
| 2.3 CDV的分离及培养 |
| 2.4 RT-PCR鉴定CDV |
| 2.5 间接免疫荧光鉴定CDV |
| 2.6测定CDV的TCID50 |
| 2.7 动物回归实验 |
| 2.8 病毒粒子形态观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞接种CDV |
| 3.2 RT-PCR鉴定CDV |
| 3.3 IFA鉴定CDV |
| 3.4 CDVTCID50测定 |
| 3.5 动物回归实验 |
| 3.6 病毒粒子形态电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 第四章 犬瘟热病毒SC1706分离株全基因组序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒和试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 PCR扩增CDV基因 |
| 2.3 CDV基因克隆及测序 |
| 2.4 CDV全基因序列比对 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增CDV基因 |
| 3.2 CDV全基因组测序 |
| 3.3 CDV-N蛋白系统发生分析树图 |
| 3.4 H基因糖基化位点预测 |
| 3.5 全基因进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）2014年中国麻疹的流行病学和四种麻疹病毒基因型H基因特征分析（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 摘要 Abstract 前言 |
| 一、麻疹 |
| 二、麻疹病毒 |
| 三、麻疹全球及我国流行趋势 |
| 四、麻疹疫苗及免疫进展 |
| 五、我国麻疹病原学监测进展 |
| 六、空间统计分析与空间决策 |
| 七、我国麻疹消除课题 材料与方法 |
| 一、数据来源 |
| 1.1 流行病学调查信息 |
| 1.2 核酸检测结果 |
| 1.3 病毒分离结果 |
| 1.4 基因型鉴定结果 |
| 二、实验耗材与实验方法 |
| 2.1 毒株来源与病毒分离 |
| 2.2 细胞来源 |
| 三、实验试剂及主要仪器 |
| 3.1 实验试剂 |
| 3.2 主要实验仪器及作用 |
| 四、实验方法 |
| 4.1 Vero/hSLAM细胞培养相关技术 |
| 4.2 病毒分离与增殖 |
| 4.3 病毒RNA提取 |
| 4.4 RT-PCR |
| 4.5 PCR产物的检测和鉴定 |
| 4.6 N基因COOH末端片断测序 |
| 4.7 H基因全长测序 |
| 五、数据分析方法 |
| 5.1 序列整理和其他相关分析软件 |
| 5.2 流行病学分析方法 |
| 六、技术路线 结果 |
| 一、麻疹传统流行病学分析 |
| 1.1 流行病学特征 |
| 1.2 时间分布 |
| 1.3 人群分布 |
| 1.4 地区分布 |
| 1.5 暴发分析 |
| 1.6 含麻疹成分疫苗接种史 |
| 1.7 临床症状 |
| 二、空间流行病学分析 |
| 2.1 空间自相关分析 |
| 2.2 时空模型 |
| 三、麻疹病毒分子流行病学分析(基于N基因羧基末端450bp) |
| 3.1 麻疹病毒的分离和RT-PCR鉴定 |
| 3.2 各省麻疹野毒株代表株及其标准命名 |
| 3.3 麻疹野毒株基因型鉴定结果分析 |
| 3.4 麻疹野毒株基因序列同源性分析 |
| 四、麻疹病毒四种基因型分离株H基因全长核苷酸和氨基酸特征分析 |
| 4.1 分离毒株来源及基因定型 |
| 4.2 RT-PCR结果 |
| 4.3 序列分析 总结与讨论 |
| 1 流行病学部分 |
| 1.1 传统流行病学 |
| 1.2 空间统计分析 |
| 2 基因特征分析 |
| 2.1 分子流行病学 |
| 2.2 H基因特征分析 |
| 3 总结 参考文献 文献综述 |
| 一、麻疹新特点 |
| 二、0～8月龄婴儿麻疹抗体水平与感染危险因素 |
| 三、成人麻疹抗体水平与感染危险因素 |
| 综述参考文献 攻读学位期间发表论文情况 致谢 |
（7）小反刍兽疫病毒贵州株分离鉴定及相关基因序列分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 文献综述 |
| 实验研究 |
| 第一章 小反刍兽疫RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 疫苗及病料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 小反刍兽疫一步法RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2 TaqMan 探针一步法实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 小反刍兽疫一步法RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2 PPRV Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于小反刍兽疫诊断 |
| 4.2 关于小反刍兽疫快速诊断方法 |
| 4.3 关于小反刍兽疫病例快速诊断样本选择 |
| 第二章 贵州小反刍兽疫流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 血清样本及病料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 血清流行病学调查 |
| 2.2 病原流行病学调查 |
| 2.3 分子流行病学调查 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清流行病学调查结果 |
| 3.2 病原流行病学调查结果 |
| 3.3 PPR 分子流行病学调查结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于PPR血清流行病学调查 |
| 4.2 关于PPR病原流行病学调查 |
| 4.3 关于 PPRV 分子流行病学调查 |
| 第三章 小反刍兽疫病毒贵州流行株分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞及病料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PPRV的分离 |
| 2.2 PPRV的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞培养及病毒分离 |
| 3.2 病毒的鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于 PRRV 细胞培养特征 |
| 4.2 关于 PRRV 病毒分离鉴定 |
| 第四章 小反刍兽疫病毒贵州流行株全基因序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 样本来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PPRV全基因组的扩增 |
| 2.2 PPRV 基因克隆与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 PPRV全基因组分段RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 PPRV全基因组克隆与鉴定结果 |
| 3.3 PPRV全基因组序列分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于病毒基因组全基因测序 |
| 4.2 关于PPRV全基因组基因特征分析 |
| 4.3 关于PPRV PX株和SY株的遗传进化分析 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 参与发表文章情况 |
| 附录二 各种培养基、溶液及试剂的配制 |
（8）PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 小反刍兽疫及小反刍兽疫病毒概述 |
| 1 小反刍兽疫病毒简论 |
| 2 病理学 |
| 3 流行病学 |
| 4 小反刍兽疫的诊断技术 |
| 5 小反刍兽疫的防控 |
| 第二章 病毒样颗粒概述 |
| 1 病毒样颗粒的分类 |
| 2 病毒样颗粒的表达系统 |
| 3 病毒样颗粒的免疫原性 |
| 4 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 小反刍兽疫病毒M、F、H蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 PPRV M蛋白多克隆抗体制备 |
| 2.2 PPRV F蛋白多克隆抗体制备 |
| 2.3 PPRV H蛋白多克隆抗体制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 PPRV M蛋白多克隆抗体的制备 |
| 3.2 PPRV F蛋白多克隆抗体的制备 |
| 3.3 PPRV H蛋白多克隆抗体的制备 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1 株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 小反刍兽疫病毒tibet/geg/07-30株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 PPRV病毒样颗粒的高效表达研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（9）我国本土H1基因型麻疹野病毒中和抗原基因和抗原位点变异变迁研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 缩略语 前言 1. |
| 麻疹病毒概述 2. |
| 我国麻疹病毒流行病学及分子流行病学 3. |
| 中和抗原基因及抗原位点研究进展 材料和方法 1. |
| 麻疹监测网络 2. |
| 标本的选取 3. |
| 细胞培养、病毒分离及鉴定 4. |
| RT-PCR 5. |
| 序列测定 6. |
| GenBank来源序列的收集整理 7. |
| 生物信息学分析 8. |
| 主要仪器及试剂 结果 1. |
| 我国麻疹流行病学监测 2. |
| 麻疹CPE病变特点 3. |
| RT—PCR及其产物纯化 4. |
| 序列测定结果 5. |
| H、F和N基因亲缘性关系树 6. |
| H1基因型麻疹病毒H基因特征分析 7. |
| H1基因型麻疹病毒F基因特征分析 8. |
| H、F基因共进化分析 9. |
| H1基因型麻疹病毒分子起源、进化分析 10. |
| H1基因型麻疹病毒多态性分析 11. |
| 基于HA蛋白晶体结构的麻疹病毒受体结合位点稳定性分析 12. |
| 基于HA蛋白晶体结构的抗原稳定性分析 13. |
| 抗原位点、受体结合位点在晶体结构的空间关系 14. |
| H基因氨基酸变异位点在HA蛋白晶体结构中的位置 讨论 1. |
| 对我国近年来麻疹持续流行的启示 2. |
| 我国流行的麻疹野病毒分子流行病学特征 3. |
| H1基因型麻疹野病毒中和抗原基因特征 4. |
| H1基因型麻疹病毒的进化 5. |
| H1基因型麻疹野病毒的抗原稳定性 6. |
| H基因氨基酸变异位点对HA蛋白功能的影响推测 结论 论文综述 参考文献 致谢 攻读学位期间发表文章 附件 |
（10）犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一篇 绪论 |
| 1.1 犬瘟热概述 |
| 1.1.1 犬瘟热病毒 |
| 1.1.2 病毒分离培养 |
| 1.1.3 病毒蛋白 |
| 1.1.4 致病机理和临床特征 |
| 1.1.5 流行病学 |
| 1.1.6 犬瘟热疫苗研究现状 |
| 1.1.7 犬瘟热病毒感染性克隆研究现状 |
| 1.2 犬瘟热病毒受体研究进展 |
| 1.2.1 信号淋巴细胞激活分子 |
| 1.2.2 Nectin-4 |
| 1.2.3 其他受体 |
| 1.2.4 总结 |
| 1.3 白细胞介素 18 研究进展 |
| 1.3.1 IL-18 的发现 |
| 1.3.2 IL-18 分子结构 |
| 1.3.3 IL-18 基因及基因调节 |
| 1.3.4 IL-18 产生和递呈 |
| 1.3.5 IL-18 的生物学功能 |
| 1.3.6 IL-18 对宿主免疫保护作用 |
| 1.3.7 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 表达犬瘟热病毒 SLAM 受体的敏感细胞系构建及病毒分离与鉴定 |
| 1.1 材料方法 |
| 1.1.1 病料、质粒和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 引物的设计与合成 |
| 1.1.4 真核表达载体构建 |
| 1.1.5 表达 SLAM 蛋白 Vero 细胞系的构建 |
| 1.1.6 RT-PCR 方法鉴定 SLAM/Vero 细胞系 |
| 1.1.7 间接免疫荧光方法鉴定 |
| 1.1.8 流式细胞检测 SLAM/Vero 细胞系 |
| 1.1.9 猴源和犬源 CDV 的分离与鉴定 |
| 1.1.10 病毒在 SLAM／Vero 细胞生长特性研究 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 真核表达载体的构建 |
| 1.2.2 SLAM/Vero 细胞系的构建与鉴定 |
| 1.2.3 利用 Vero/DogSLAM 细胞系分离犬瘟热病毒 |
| 1.2.4 犬源 CDV 和猴源 CDV 对不同动物 SLAM 受体利用比较分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 现行不同疫苗株犬瘟热病毒免疫效果评价及其 H 蛋白基因特性分析研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 疫苗毒株、细胞和动物细胞、质粒与单克隆抗体 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 不同疫苗株 CDV 在犬和狐狸体内免疫效果评价 |
| 2.1.4 引物的设计与合成 |
| 2.1.5 RT-PCR 克隆 4 株疫苗株 CDV 的 H 基因 |
| 2.1.6 CDV H 基因序列分析 |
| 2.1.7 真核表达载体构建 |
| 2.1.8 细胞转染 |
| 2.1.9 间接免疫荧光检测 |
| 2.1.10 犬瘟热病毒 H 蛋白三维构象建立 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同疫苗株 CDV 在犬和狐狸体内免疫效果评估 |
| 2.2.2 PCR 扩增结果 |
| 2.2.3 不同毒株 H 基因核苷酸及其对应的氨基酸同源性比较 |
| 2.2.4 H 基因系统发生进化树分析 |
| 2.2.5 H 基因氨基酸序列分析结果 |
| 2.2.6 犬瘟热病毒 H 蛋白糖基化位点分析 |
| 2.2.7 野生株和疫苗株犬瘟热病毒 H 蛋白同源模型构建及比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达白细胞介素 18 的重组犬瘟热病毒感染性克隆构建与初步应用 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 病毒株，质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 引物的设计与合成 |
| 3.1.4 感染性克隆载体的构建 |
| 3.1.5 病毒的拯救 |
| 3.1.6 RT-PCR 及测序鉴定 |
| 3.1.7 Western blotting 鉴定 |
| 3.1.8 重组病毒的培养与滴定 |
| 3.1.9 重组病毒生长动力学研究 |
| 3.1.10 IL-18 的生物活性评估 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 表达犬 IL-18 基因的重组真核表达载体构建 |
| 3.2.2 不同载体体系表达的 IL-18 活性评定 |
| 3.2.3 粘附人 IL-2 信号肽的犬或鼠 IL-18 的重组犬瘟热病毒载体构建 |
| 3.2.4 重组病毒的拯救及其鉴定 |
| 3.2.5 Western blotting 鉴定重组病毒 |
| 3.2.6 重组病毒生长动力学研究 |
| 3.2.7 重组病毒分泌 IL-18 的生物活性能力检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间所得的科研成果 |
| 致谢 |
四、用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白(H)基因（论文参考文献）
- [1]基于小反刍兽疫病毒H蛋白的间接ELISA方法建立及晶体培养[D]. 薛晓茵. 中国兽医药品监察所, 2021(01)
- [2]犬瘟热病毒对人SLAM受体适应机制及其在人SLAM转基因小鼠体内复制的研究[D]. 冉伟. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [3]犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立[D]. 孙伟伟. 西藏大学, 2020(12)
- [4]犬瘟热病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立[D]. 苏瑞红. 东北农业大学, 2018(11)
- [5]稳定表达犬瘟热病毒SLAM受体细胞系的建立及犬瘟热病毒的分离与鉴定[D]. 朱璐. 四川农业大学, 2018(02)
- [6]2014年中国麻疹的流行病学和四种麻疹病毒基因型H基因特征分析[D]. 任丽. 中国疾病预防控制中心, 2016(03)
- [7]小反刍兽疫病毒贵州株分离鉴定及相关基因序列分析[D]. 王琦. 贵州大学, 2016
- [8]PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究[D]. 闫飞虎. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(02)
- [9]我国本土H1基因型麻疹野病毒中和抗原基因和抗原位点变异变迁研究[D]. 许松涛. 中国疾病预防控制中心, 2015(01)
- [10]犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究[D]. 刘玉秀. 吉林大学, 2014(01)