刘婧媛(辽阳市疾病预防控制中心质量管理科辽宁辽阳111000）
【摘要】流行性感冒病毒是引起急性呼吸道感染的重要病原，传播迅速,常会引起暴发，甚至造成世界大流行。上世纪流感病毒就引起四次世界大流行，造成相当严重的损失[1]。目的为了探究流感病毒流行和变异规律，了解其根据流感病毒核蛋白（NP），M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲（A）乙（B）丙（C）三型[2],病毒具有抗原性变异的特性,提供控制流行的科学依据,对2011—2013年度辽阳市流行性感冒的病原学监测结果进行分析。方法采集流感样病例的咽拭子标本,采用realtime-PCR进行核酸检测，分别用人红细胞、狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制方法(HAI)进行流感病毒型别鉴定。结果2011年4月~2012年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本388份,核酸检测PCR阳性13例，分离到流感病毒10株,阳性分离率为2.58%,经分型鉴定A型H3N2亚型2株(20%),B型Victoria5株(50%),B型Yamagata3株(30%),A型H1N1亚型、新H1N1未检出；2012年4月~2013年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本593份,核酸检测PCR阳性40例，分离到流感病毒30株,阳性分离率为5.06%,经分型鉴定A型H1N1亚型2株(6.67%)，A型H3N2亚型,15株(50%),新H1N112株(40%)，B型Yamagata,1株(3.33%)，B型Victoria未检出。结论:2011~2012年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为B型,同时有A型H3N2亚型毒株的存在；2012~2013年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为A型H3N2亚型和新H1N1,同时有A型H1N1亚型、B型Yamagata毒株的存在。
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）39-0179-02
1.材料和方法
1.1标本
2011年4月1日-2012年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本388份；2012年4月1日-2013年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本593份。
1.2流感病毒核酸realtime-PCR
1.2.1采用QuantOnestepRT-PCRkitRNA提取试剂盒提取流感病毒样本核酸。
1.2.2QIAGENrealtime(荧光定量PCR法)检测试剂盒扩增病毒核酸，反应体系见表1
组分体积（μl）2×QuantiTextProbeRT-PCRMasterMix12.5×上游引物（40μM）0.5×下游引物（40μM）0.5×Probe（10μM）0.5×QuantiTextRTMix0.25×RneasyFreeWaterUPto25病毒核酸RNA5.0×
1.2.3将上述加好的反应体系的反应管放于PCR仪进行反应，反应程序如下：见表2
步骤反应温度(℃)时间(min)是否采集荧光循环数逆转录酶605否15030否1预扩增9515否1950.25否45扩增及荧光收集550.5否45720.5是45725否1
1.2.4结果判定及标准
对照：阴性对照无CT值或CT值为零，阳性对照CT值＜30。
样品：CT值≤35报告为阳性。
样品：37≤CT值≤40为灰区，需重新采样检测。
样品：无CT值或CT值为零报告为阴性。
1.3流感病毒分离
上述PCR结果为阳性的样本接种培养好的MDCK细胞生长液，观察细胞病变情况。
1.3.1将已长成单成的MDCK细胞生长液，用DPBS液洗两遍。
1.3.2每瓶接种标本0.5ml，每个标本接种1瓶，轻摇，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附2小时。
1.3.3倒掉感染液，用DPBS液洗两遍，每瓶加入含2μg/ml胰酶的病毒维持液10ml，35℃培养。
1.3.4次日起每天观察有无细胞病变（CPE）并记录，如病变明显细胞脱落可收获并做血凝，如未有病变，继续观察7日收获做血凝。
1.4血凝实验
1.4.1取聚乙烯96孔板。
1.4.2从第二排起每孔加50μL生理盐水。
1.4.3第一排每孔加入待测物100μL。
1.4.4从一排取50μL向后微倍比稀释至最后一排50μL，弃去。
1.4.5每孔加1.5%豚鼠血球50μL，混匀，置室温1小时看结果。
2.结果
2011年4月~2012年3月共检测咽拭子标本388份,核酸检测PCR阳性13例，分离到流感病毒10株,阳性分离率为2.58%；2012年4月~2013年3月共检测辽阳市咽拭子标本593份,核酸检测PCR阳性40例，分离到流感病毒30株,阳性分离率为5.06%。2011~2013年度流感流行季节中辽阳市均有流感流行,流行的优势毒株不同，2011~2012流行的优势毒株为B型,同时有A型H3N2亚型毒株的存在；2012~2013年度流行的优势毒株为A型H3N2亚型和新H1N1,同时有A型H1N1亚型、B型Yamagata毒株的存在。详细情况见表3：
年份标本数量(份)PCR结果分离毒株数分离率型别甲1甲3新H1N1BVBY株%株%株%株%株%11-1238813102.58%00220%00550%330%12-1359340305.06%26.67%1550%1240%0013.33%3.讨论
2011-2013年两年间辽阳市均有流感病毒流行,通过实验室检测得知两年的流行病毒毒株型别不同,证实了流感病毒抗原性变异的特性。2011年-2012年采用人红细胞做的血抑实验，分离率为2.58%；2012年-2013年采用豚鼠红细胞做的血抑实验，分离率为5.06%。两年分析比较得出，采用豚鼠血做血抑实验明显优于人红细胞做血抑实验。
参考文献
[1]LambR,KrugRM.Orthomyxoviridae;theVirusesandtheirreplication[M].In:FieldsBN.3rded.Philadelphia;Lippincott,2001:1487-1532.
[2]WS285-2008流行性感冒诊断标准2.1