草酸青霉氮代谢及其调控的初步研究

论文摘要

纤维素是一种丰富的可再生资源,具有分布广、储量大等优点。纤维素通过转化获得的生物燃料能够有效缓解环境的恶化和促进经济的可持续发展。许多丝状真菌能够合成和分泌降解纤维素的纤维素分解酶。其中,草酸青霉（Penicillium oxalicum）的木质纤维素降解酶酶系比较完整,以其为出发菌株的高产突变菌株已经应用到工业生产当中,在生物燃料工业的发展中具有一定的潜力。蛋白质的合成与碳、氮代谢密切相关。目前,研究者对丝状真菌中纤维素酶合成与碳代谢的关系及相关的调控机制已经获得了较为深入的认识。然而,尽管已知氮源对丝状真菌纤维素酶等胞外蛋白的产生也十分重要,对相关分子机制的研究还相当薄弱。本论文以草酸青霉为研究对象,对氮源与纤维素酶合成的关系、氮代谢相关转录因子的生物学作用及其与纤维素酶合成的关系进行了研究,研究结果可为发酵培养基的进一步优化和菌株改造和利用提供新的思路。本论文的主要研究进展如下:1.氮源种类及蛋白酶对草酸青霉纤维素酶产量的影响分别设计了以玉米浆、玉米酒糟、豆饼粉、硫酸铵、硝酸钠等作为氮源的发酵培养基,将产生纤维素酶的菌株RE-8进行9天的摇瓶发酵培养。结果显示,草酸青霉在复合氮源培养基上的产纤维素酶能力最强,在硫酸铵为唯一氮源培养基上的产酶能力最差。在复合氮源培养基中,发酵液中的铵态氮浓度呈现先下降后上升的变化曲线,酸性蛋白酶和中性蛋白酶的活力都呈逐渐积累状态。在培养基中加入一定浓度蛋白酶抑制剂后,细胞外蛋白酶活力显著降低,细胞外蛋白浓度增加,然而,纤维素酶活性变化不大,并且在发酵后期仍显示略微的下降趋势。2.草酸青霉氮源分解代谢转录因子AreA的生物学功能研究AreA是真菌中保守的氮分解代谢转录因子,一般认为负责次级氮源代谢基因表达的激活。本论文构建了areA的DNA结合结构域缺失突变菌株和回补菌株,研究了氮源种类对草酸青霉纤维素酶基因表达的影响,以及转录调控因子AreA在草酸青霉氮源利用和纤维素酶基因表达中的作用。结果表明,氮源对野生菌株中纤维素酶基因表达的影响与碳源的类型有关。AreA不仅对草酸青霉利用次级氮源是必须的,对硫酸铵等易利用氮源的利用也是非常重要的,这与曲霉中的研究结果有所不同。AreA对铵盐代谢相关基因以和纤维素酶相关基因的表达具有调控作用。在纤维素诱导条件下,敲除areA基因导致纤维素酶基因表达的显著下调。3.氨基酸合成调控因子CpcA在草酸青霉菌生长和胞外酶产生中的作用研究CpcA是真菌中保守的跨途径氨基酸合成代谢转录激活因子。本论文构建了草酸青霉cpcA敲除菌株ΔcpcA,并构建了cpcA回补菌株RcpcA以及cpcA过表达菌株。在添加或不添加氨基酸合成抑制剂3-AT的培养基中,cpcA敲除菌株与野生菌株和回补菌株相比,细胞生长呈现出非常明显的劣势,但这种生长劣势在富含氨基酸的培养基中能够得到弥补。cpcA敲除菌株的纤维素酶、淀粉酶活力都显著低于野生菌株,且玉米浆的添加能够缩小两者酶活力之间的差异。通过研究发酵过程中细胞生长与纤维素酶产生之间的关系以及纤维素酶基因转录水平的测定,确认cpcA敲除后出现的纤维素酶产量的降低并非完全由细胞生长劣势引起。另外,发现cpcA的过表达能够显著提升淀粉酶的产量,为淀粉酶生产菌株的改造提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明及缩写
• 第一章 研究的背景及意义
•   1.1 丝状真菌纤维素酶生产与氮代谢的关系
•     1.1.1 氮源与纤维素酶生产的关系
•     1.1.2 丝状真菌胞外蛋白酶
•     1.1.3 胞外蛋白酶与纤维素酶的关系
•   1.2 丝状真菌氮代谢的调控
•     1.2.1 丝状真菌中氮代谢研究的重要性
•     1.2.2 丝状真菌中氮源分解代谢的主要调控机制
•     1.2.3 丝状真菌氮源分解代谢的调控因子
•     1.2.4 氮源分解代谢调控因子AreA的功能
•     1.2.5 丝状真菌中氨基酸合成代谢的调控
•     1.2.6 氨基酸合成代谢调控因子CpcA的功能
•   1.3 本研究目的和意义
• 第二章 氮源种类和胞外蛋白酶与草酸青霉纤维素酶产量关系的初步研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料和方法
•     2.2.1 菌株
•     2.2.2 培养基和培养方法
•     2.2.3 常用试剂和缓冲液
•     2.2.4 主要实验仪器
•     2.2.5 中性蛋白酶活力的评价（偶氮酪蛋白法）
•     2.2.6 酸性蛋白酶活力的测定（Folin法）
•     2.2.7 铵态氮样品的检测
•     2.2.8 蛋白浓度和滤纸酶活的测定
•   2.3 结果和讨论
•     2.3.1 氮源种类对胞外滤纸酶活、蛋白酶活和蛋白浓度的影响
•     2.3.2 纤维素酶发酵过程中胞外蛋白酶活力的变化
•     2.3.3 发酵液中铵态氮浓度的检测
•     2.3.4 胞外滤纸酶活力与蛋白浓度的测定
•   2.4 本章小结
• 第三章 草酸青霉氮分解代谢转录因子AreA的生物学作用研究
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料和方法
•     3.2.1 菌株和PCR引物
•     3.2.2 培养基和培养方法
•     3.2.3 常用试剂和缓冲液
•     3.2.4 主要实验仪器
•     3.2.5 孢子计数
•     3.2.6 构建areA基因敲除盒与回补盒
•     3.2.7 草酸青霉原生质体的制备与转化
•     3.2.8 石英砂法小量提取草酸青霉基因组
•     3.2.9 菌落生长测定与形态观察
•     3.2.10 丝状真菌总RNA的提取
•     3.2.11 RNA的反转录
•     3.2.12 基因转录水平测定
•   3.3 结果和讨论
•     3.3.1 不同氮源种类与纤维素酶基因转录的关系
•     3.3.2 氮源分解代谢调控因子AreA的注释与序列分析
•     3.3.3 不同氮源种类对areA基因转录的影响
•     3.3.4 areA缺失菌株和回补菌株的构建与验证
•     3.3.5 AreA在氮源利用中的作用研究
•     3.3.6 AreA对铵代谢基因表达的调控作用
•     3.3.7 AreA对纤维素酶基因表达的调控作用
•   3.4 本章小结
• 第四章 氨基酸合成调控因子CpcA在草酸青霉菌生长和胞外酶产生中的作用研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料和方法
•     4.2.1 菌株及PCR引物
•     4.2.2 培养基和培养方法
•     4.2.3 常用试剂和缓冲液
•     4.2.4 主要实验仪器
•     4.2.5 cpcA基因敲除、回补和过表达
•     4.2.6 测定草酸青霉的纤维素酶活力
•     4.2.7 草酸青霉生物量的测定
•     4.2.8 蛋白电泳凝胶的银染色
•   4.3 结果和讨论
•     4.3.1 氨基酸合成调控因子CpcA的注释与序列分析
•     4.3.2 cpcA缺失菌株和回补菌株的构建与验证
•     4.3.3 CpcA在氨基酸人工饥饿条件下的作用
•     4.3.4 CpcA在氨基酸非饥饿条件下的作用
•     4.3.5 CpcA在胞外纤维素酶和淀粉酶生产中的重要作用
•     4.3.6 CpcA对氨基酸生物合成基因和纤维素酶基因表达的作用
•     4.3.7 CpcA过表达对细胞生长及胞外酶合成的作用
•   4.4 本章小结
• 论文创新性成果及展望
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 潘云军

导师: 秦玉琪,刘国栋

关键词: 草酸青霉,转录因子,细胞生长,纤维素酶,胞外蛋白酶

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,环境科学与资源利用

单位: 山东大学

分类号: X70;Q933

总页数: 83

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