植物乳杆菌在冷冻干燥过程中生理损伤及保护策略的研究

论文摘要

本研究首先以12株植物乳杆菌为研究对象,构建了系统发育树,测定了18℃、24℃、30℃和37℃下的生长曲线、细胞膜脂肪酸组成以及冷冻干燥存活率。再通过Pearson线性检验探究这些理化特性之间的潜在相关性,尤其是脂肪酸和冷冻干燥存活率之间的相关性。综合16S rRNA基因、不同温度下生长情况、脂肪酸组成以及冷冻干燥存活率等方面筛选差异明显的植物乳杆菌菌株。查明与冷冻干燥存活率相关的脂肪酸后,以该脂肪酸差异大的两个温度为培养温度,并以蔗糖、山梨醇和PBS为保护介质测定植物乳杆菌的玻璃化转变温度、崩解温度、细胞膜特性以及冷冻干燥后糖代谢关键酶的酶活,以解析脂肪酸差异、菌株差异以及保护介质差异在冷冻干燥过程中造成的不同生理损伤的原因。最后,结合生理损伤机制,通过不同的保护策略提高植物乳杆菌的冷冻干燥存活率,并进行机制验证,主要包括培养过程中脂肪酸的添加、更换不同的保护剂以及保护剂的复配、冷冻干燥工艺的优化等策略。主要结论如下:首先,12株植物乳杆菌的系统发育树表明,实验所用菌株的16S rRNA基因各不相同,为植物乳杆菌的12个不同的菌株;18℃、24℃、30℃、37℃下的生长曲线结果表明,当温度由37℃降低到18℃时,12种植物乳杆菌的比生长率由0.12～0.25 OD600/h减小至0.01～0.04 OD600/h,迟滞期时间由2.64～5.00 h增加到6.41～13.75 h。脂肪酸组成结果表明,在植物乳杆菌细胞膜中检测到4种脂肪酸相对含量较高:十六烷酸（C16:0）、十八烷酸（C18:0）、十八碳烯酸（C18:1）和十九碳烯酸（C19:1）,十四烷酸（C14:0）、十六碳烯酸（C16:1）和十八碳二烯酸（C18:2）的相对含量较低。当温度由37℃降低到18℃时,12株植物乳杆菌的不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的比值（U/S）由0.42～0.79增大至0.66～2.05,即膜脂肪酸朝不饱和的趋势发展;冷冻干燥存活率结果表明,与PBS相比,蔗糖、山梨醇都具有显著的保护效果。其中,蔗糖的效果更好,将植物乳杆菌的冷冻存活率提高了10～77%,干燥存活率提高了20～82%,冷冻干燥存活率提高了30～78%。Pearson线性相关系数表明,冷冻干燥存活率与C18:1的相对含量和U/S呈正相关。U/S和C18:1的相对含量似乎是与植物乳杆菌冷冻干燥抗性最相关的参数。另外,基于16S rRNA基因、低温下生长速率和迟滞期时间、脂肪酸组成以及冷冻干燥存活率等方面筛选获得差异大的三株菌:AR113、AR307和WCFS1,便于后续实验。以C18:1为主线,以其相对含量差异大的18℃和37℃两个温度为培养温度,以PBS、山梨醇和蔗糖为保护剂,探究植物乳杆菌的菌株差异、脂肪酸组成差异以及保护剂差异造成冷冻干燥存活率差异的原因。结果显示,就保护剂而言,相较于PBS,蔗糖主要通过提高玻璃化转变温度、崩解温度、细胞膜完整性及流动性、LDH以及ATP比酶活力等方面从而提高植物乳杆菌的冷冻干燥抗性,山梨醇则主要是通过LDH以及ATP比酶活力等方面从而提高植物乳杆菌的冷冻干燥抗性;而菌株之间产生冷冻干燥抗性差异的原因主要是细胞膜完整性及流动性、LDH以及ATP比酶活力等的差异。结合原因,采取了相应的保护策略以提好植物乳杆菌的冷冻干燥存活率并进行了原因验证,所得结果如下:C18:1的添加导致了细胞膜流动性、LDH酶活、ATP酶活的增加,从而将冷冻干燥存活率提高了6～62%。通过更换保护剂,发现小分子糖类中蔗糖和海藻糖的保护效果显著优于甘露糖,能将冷冻干燥存活率提高到40～80%。醇类的保护效果也较差,冷冻干燥后的存活率均低于15%。大分子糖类效果都较好,能将冷冻干燥存活率提高到7～74%之间。由于单一保护剂的效果都达不到80%以上,于是将保护剂进行了复配,并在最佳复配保护剂存在的情况下,对冷冻温度这一冷冻干燥参数进行了优化。最终,我们得到AR113的最佳保护剂为大豆多糖+海藻糖,且在预冻温度为-20℃时,存活率最大,为91.0%;AR307的最佳保护剂为大豆多糖+蔗糖+甘露醇,其在-40℃时,冷冻干燥存活率最高,达81.0%;WCFS1的最佳保护剂为大豆多糖+海藻糖,-196℃的预冻温度使其冷冻干燥存活率最高,达94.4%。通过研究发现复配保护剂能提高冷冻干燥存活率的原因是其能提高玻璃化转变温度和崩解温度,增强细胞膜的完整性和流动性,还能增加ATP酶和PK酶的活力。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
•   1.1 益生菌概述
•     1.1.1 益生菌的定义
•     1.1.2 益生菌的分类
•     1.1.3 益生菌的功能
•     1.1.4 植物乳杆菌概述
•   1.2 冷冻干燥概述
•     1.2.1 冷冻干燥简介
•     1.2.2 冷冻干燥过程
•     1.2.3 冷冻干燥生理损伤
•     1.2.4 影响冷冻干燥作用的因素
•     1.2.5 冷冻干燥中存在的问题
•   1.3 研究目的和意义
•   1.4 研究内容
• 第二章 不同植物乳杆菌膜脂肪酸组成与其冷冻干燥存活率关系的探究
•   2.1 前言
•   2.2 材料与设备
•     2.2.1 菌株
•     2.2.2 培养基
•     2.2.3 主要材料与试剂
•     2.2.4 主要仪器与设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 菌种活化及培养方法
•     2.3.2 系统发育树构建
•     2.3.3 生长曲线、迟滞期及比生长速率测定
•     2.3.4 细胞膜脂肪酸测定
•     2.3.5 冷冻、干燥及冷冻干燥存活率测定
•     2.3.6 Pearson线性相关系数
•   2.4 实验结果与讨论
•     2.4.1 进化树远近关系
•     2.4.2 生长曲线、迟滞期时间及比生长速率差异
•     2.4.3 细胞膜脂肪酸组成差异
•     2.4.4 冷冻存活率、干燥存活率、冷冻干燥存活率差异
•     2.4.5 Pearson线性相关关系建立
•   2.5 本章小结
• 第三章 冷冻干燥过程中生理损伤原因解析
•   3.1 前言
•   3.2 材料与设备
•     3.2.1 菌株
•     3.2.2 培养基
•     3.2.3 主要材料与试剂
•     3.2.4 主要仪器与设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 菌种活化及培养方法
•     3.3.2 样品准备及冷冻干燥过程
•     3.3.3 玻璃化转变温度和崩解温度测定
•     3.3.4 植物乳杆菌细胞膜完整性测定
•     3.3.5 植物乳杆菌细胞膜流动性测定
•     3.3.6 无细胞提取液制备
•     3.3.7 LDH的测定
•     3.3.8 其他酶活的测定
•     3.3.9 数据处理
•   3.4 实验结果与讨论
•     3.4.1 玻璃化转变温度和崩解温度
•     3.4.2 细胞膜完整性
•     3.4.3 细胞膜流动性
•     3.4.4 冷冻干燥对植物乳杆菌LDH的影响
•     3.4.5 冷冻干燥对植物乳杆菌PK的影响
•     3.4.6 冷冻干燥对植物乳杆菌ATP酶的影响
•   3.5 本章小结
• 第四章 冷冻干燥过程中保护策略的研究
•   4.1 前言
•   4.2 材料与设备
•     4.2.1 菌株
•     4.2.2 培养基
•     4.2.3 主要材料与试剂
•     4.2.4 主要仪器与设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 菌种活化及培养方法
•     4.3.2 脂肪酸的添加对存活率的影响
•     4.3.3 脂肪酸添加影响存活率的原因验证
•     4.3.4 不同单保护剂对存活率的影响
•     4.3.5 保护剂复配对存活率的影响
•     4.3.6 保护剂复配影响存活率的原因验证
•     4.3.7 冷冻干燥
•     4.3.8 冷冻温度对存活率的影响
•   4.4 实验结果与讨论
•     4.4.1 脂肪酸的添加对存活率的影响
•     4.4.2 脂肪酸添加对玻璃化转变温度和崩解温度的影响
•     4.4.3 脂肪酸添加对细胞膜完整性的影响
•     4.4.4 脂肪酸添加对细胞膜流动性的影响
•     4.4.5 脂肪酸添加对LDH比酶活力的影响
•     4.4.6 脂肪酸添加对PK比酶活力的影响
•     4.4.7 脂肪酸添加对ATP比酶活力的影响
•     4.4.8 不同单保护剂对存活率的影响
•     4.4.9 保护剂复配对存活率的影响
•     4.4.10 保护剂复配对玻璃化转变温度、崩解温度的影响
•     4.4.11 保护剂复配对细胞膜完整性的影响
•     4.4.12 保护剂复配对LDH比酶活力的影响
•     4.4.13 保护剂复配对PK比酶活力的影响
•     4.4.14 保护剂复配对ATP比酶活力的影响
•     4.4.15 冷冻温度对存活率的影响
•   4.5 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 总结
•   5.2 展望
• 参考文献
• 在读期间公开发表的论文和承担科研项目及取得成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 于小青

导师: 王光强

关键词: 植物乳杆菌,冷冻干燥,保护剂,玻璃化转变温度,崩解温度,膜流动性,膜完整性,酶活

来源: 上海理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 上海理工大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27308/d.cnki.gslgu.2019.000016

总页数: 86

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