利用CRISPR/Cas9技术创制大豆高油酸突变系

论文摘要

大豆是重要的油料兼经济作物。大豆油中富含多不饱和脂肪酸,容易被氧化。油酸作为一种单不饱和脂肪酸,是大豆油的重要组成部分,它性质稳定、不容易被氧化,在人体的脂类代谢中能降低有害胆固醇,保持有益胆固醇,从而减缓动脉粥样硬化,有效预防心血管疾病发生的几率。因此,油酸含量是评价大豆油脂品质的重要指标,高油酸大豆育种是大豆品质育种的重要目标之一。在脂肪酸合成途径中,Δ12-脂肪酸脱饱和酶（FAD2）是催化油酸转化为亚油酸的关键酶。FAD2-1A和FAD2-1B基因主要在发育的种子中表达,并被认为在控制种子油酸含量中起着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术定向编辑控制油酸含量的两个关键基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B,创制大豆FAD2-1基因突变体,为高油酸育种提供了新的种质资源并创建了方法。主要研究结果如下:1.根据大豆GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因的序列,同时设计了3个分别由AtU3d、AtU3b和AtU6-1启动子驱动、长20 bp的guide RNA（gRNA）靶点以靶向编辑GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因的外显子区,并且将这3个靶点一起组装到pYLCRISPR/Cas9-DB载体上。利用农杆菌介导大豆子叶节的方法分别转化大豆材料华夏3号（H3）与东农50（DN50）,两种材料各获得了3株转基因植株;2.通过PCR技术及测序分析对T0代转基因大豆植株靶点编辑情况进行检测,分析所有转化材料的突变情况。经检测分析发现T0代H3与DN50转化植株中,两种材料都只有GmFAD2-1A基因发生编辑,H3与DN50的突变率都约为33%,都为单靶点突变;3.GmFAD2-1A-H3突变体和GmFAD2-1A-DN50突变体大豆株系在株高、主茎节数、单株分枝数、叶形、花色、种皮色、种脐色、生育期等方面分别与对照品种均没有明显差异,突变体大豆的蛋白和脂肪含量与对照品种也无显著差异,表明GmFAD2-1A基因的突变对转基因大豆的农艺性状表型没有影响,对大豆种子中总蛋白和总脂肪的积累也没有影响;4.GmFAD2-1A-H3突变体与GmFAD2-1A-DN50突变体中,油酸含量都得到极显著提高,其中GmFAD2-1A-H3突变体的油酸含量从20%提高到了23%,而GmFAD2-1A-DN50突变体的油酸含量从17.5%提高到了23%,分别提高了3%和5.5%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 植物脂肪酸研究进展
•     1.1.1 植物脂肪酸的生理功能
•     1.1.2 植物脂肪酸的合成途径
•   1.2 油酸及其生理功能
•   1.3 FAD2 基因的研究
•     1.3.1 FAD2 的性质与作用机理
•     1.3.2 FAD2 基因在植物中的研究
•     1.3.3 FAD2 基因在大豆中的研究
•   1.4 基因编辑技术发展历程
•     1.4.1 锌指核酸酶技术
•     1.4.2 类转录激活因子效应物核酸酶技术
•     1.4.3 CRISPR/Cas9 技术
•   1.5 CRISPR/Cas系统
•     1.5.1 CRISPR/Cas系统的研究历程
•     1.5.2 CRISPR/Cas系统的分类
•     1.5.3 CRISPR/Cas系统的结构
•     1.5.4 CRISPR/Cas的作用原理
•     1.5.5 人工合成的CRISPR/Cas9 系统
•   1.6 CRISPR/Cas9 与其他基因编辑技术比较
•   1.7 选题意义和目的
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌种及载体
•     2.1.3 主要试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 靶点选择及其寡核苷酸链引物的设计
•     2.2.2 三靶点pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA载体的构建
•     2.2.3 农杆菌介导大豆子叶节遗传转化
•     2.2.4 转基因大豆的检测
•     2.2.5 品质分析及农艺性状调查
•     2.2.6 发根农杆菌介导法转化大豆子叶节
• 第三章 结果与分析
•   3.1 g RNA靶点以及寡核苷酸序列设计
•   3.2 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA表达载体的构建与验证
•   3.3 重组质粒pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA转化农杆菌
•   3.4 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA转化大豆及阳性植株的鉴定
•     3.4.1 转基因植株的获得
•     3.4.2 Gm FAD2-1 大豆突变体的鉴定
•   3.5 突变体植株农艺性状调查及品质分析
•     3.5.1 突变体植株农艺性状调查
•     3.5.2 突变体植株脂肪酸组分含量测定
• 第四章 讨论
•   4.1 GmFAD2-1A与 GmFAD2-1B基因对大豆种子油酸含量的影响
•   4.2 CRISPR/Cas9 系统创制大豆高油酸突变体的讨论
•   4.3 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化影响因素
•   4.4 大豆转化所用品种的优势
•   4.5 发根农杆菌侵染大豆诱导毛状根
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 侯智红

导师: 刘宝辉

关键词: 大豆,脂肪酸,油酸

来源: 广州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 广州大学

基金: 国家自然科学基金项目(31771815,31701445,31801384)

分类号: Q943

总页数: 75

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