褪黑素在盐胁迫条件下对莱茵衣藻和莜麦抗氧化能力的影响

论文摘要

褪黑素（N-乙酰基-甲氧基色胺,melatonin,MT）在动物体内中具有抗氧化作用,植物体内可能有类似功能。作为一种多效信号分子,MT能增强植物对各种生物和非生物胁迫的耐受性,在植物生长、发育和环境胁迫中具有重要作用。研究资料显示MT诱导植物抗氧化酶活性,增强植物的抗逆性能,在绿藻中同样表现着良好的盐胁迫防御特性,但是MT抗氧化保护作用的机制还有很多未知。“绿色酵母”莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一种单细胞绿藻,生长速度快,分子遗传学背景简单,常被当做模式微藻用于植物功能基因及次生代谢产物等研究。禾本科燕麦属植物莜麦又称裸燕麦（Avena nuda L.）,是我国高寒山区特有的优质杂粮之一,具有独特的营养价值和保健功能,但是其生长受到非生物胁迫限制,制约其利用和发展。二者的研究中,有关MT功能资料还很匮乏,盐胁迫条件下单细胞藻类和高等植物莜麦中的MT功能研究薄弱。本研究分别以莱茵衣藻和莜麦为实验材料,探讨MT在植物中的抗氧化功能。具体包含两部分内容:一部分是借助微藻基因工程的反义RNA技术,玻璃珠法转化莱茵衣藻CC-503,获得MT合酶基因AANAT沉默的转基因莱茵衣藻,进而探讨盐胁迫下莱茵衣藻生长及抗氧化变化;另一部分关注外源施加MT条件下,高等植物莜麦的盐胁迫响应。通过本论文探讨盐胁迫中MT对植物生长的保护力,为植物中MT的功能研究提供参考,推动MT在藻类及植物中的功能研究。主要研究内容如下:（1）构建了含目的基因aanat的莱茵衣藻核反义表达载体pDBle-aanat:将已获得的含有目的片段aanat的克隆载体pMD18-aanat双酶切并纯化回收目的片段,然后用T4-DNA连接酶将aanat基因片段反向连接到pDBle载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经PCR、双酶切和测序进行鉴定目的菌株的鉴定,结果表明表达载体构建正确。（2）莱茵衣藻的遗传转化及筛选鉴定,获得转化藻株:莱茵衣藻的遗传转化及筛选鉴定,转化藻株经过博来霉素（Ble）抗性筛选培养后,再提取转化衣藻的DNA和RNA,分别进行ble基因PCR检测及AANAT基因表达水平qRT-PCR的检测等方法,最终获得了阳性藻株ARn（n为不同转基因藻系）,并证明了aanat基因成功整合进了衣藻核基因组中并下调了AANAT基因的表达。（3）转基因藻株的生长情况:分别测定野生型藻（WT）和ARn藻系的OD值,连续7 d数据统计显示,ARn系的生长曲线趋势与WT藻系基本相一致,没有受到外源aanat基因整合的影响,只是转基因藻细胞密度较低。但是测定的不同ARn藻系中MT的含量平均为10.37 pg/mL,低于野生藻（MT含量为11.86 pg/mL）,证实莱茵衣藻核基因组中AANAT基因沉默降低了MT的合成。（4）aanat基因沉默微藻（内源MT）在盐胁迫处理中的生理响应:（1）测定了不同藻株细胞内MT浓度,发现转化藻株AR3中MT浓度均显著（p<0.05）地低于未转化藻株,说明AANAT基因沉默藻株AR3在盐胁迫后MT含量降低;（2）在50 mM和100 mM NaCl胁迫环境中,与WT衣藻相比,AR3藻株中清除活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的能力较弱一些;抗氧化物酶活性和基因的表达情况均降低/下调。此结果说明了AR3清除ROS和恢复细胞损伤的能力减弱。（5）外源MT对莜麦盐胁迫下的防护作用:（1）在150 mM NaCl盐胁迫下,外施不同浓度MT处理后,莜麦的株高、茎粗、鲜重、干重、叶绿素含量、叶面积和叶体积均增加;而叶绿素合成酶基因（ChlG）的表达量平均提高了6.40倍。这些结果说明MT有利于植物生长;（2）在150 mM NaCl盐胁迫下,外施不同浓度MT处理后,莜麦幼苗叶片过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子(O2·-)和MDA含量减少;超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性均提高。该结果显示出MT可以提高植物抗氧化能力,可能是通过清除细胞ROS和增加抗氧化物酶的活性来实现这一功能;（3）150 mM NaCl盐胁迫下,外施不同浓度MT处理后,渗透调节物质脯氨酸的含量均增加;而细胞内可溶性蛋白含量则降低;细胞内脂质过氧化物酶基因（LOX和POX）表达量均上调。这些结果证实了在莜麦中脯氨酸可能是主要的渗透调节物质,同时也证实了MT可以诱导细胞抗盐性相关基因的表达,进而提高植物对盐胁迫的耐受性;（4）在150 mM NaCl盐胁迫下,外施不同浓度MT处理后促分裂原活化白激酶（MAPK）级联途径中的MAPK蛋白激酶（Asmap1和Aspk11）基因表达量均上调以及转录因子（TFs）NAC、WRKY1、WRKY3和MYB的表达量也均上调。这些结果揭示了MT在盐胁迫缓解中的重要作用,推测MT可能有类似与油菜素内酯（BRs）的作用,即通过介导MAPK介导H2O2信号通路,促进抗盐胁迫相关基因表达,进而提高莜麦对盐胁迫的耐受性。不管是MT合酶基因AANAT的低表达实验,还是外施MT实验均证实了MT的确具有抗氧化的功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语对照表
• 第一章 绪论
•   1.1 盐胁迫对植物的影响及植物的耐盐机制
•     1.1.1 盐胁迫对植物的影响
•     1.1.2 植物的耐盐机制
•   1.2 MT在植物中的研究进展
•     1.2.1 MT在植物中的生物合成途径
•     1.2.2 MT对植物生长发育的调控作用
•     1.2.3 MT在逆境中的作用
•   1.3 莜麦的研究现状
•   1.4 微藻研究现状
•     1.4.1 微藻综述
•     1.4.2 MT在微藻中的研究进展
•   1.5 研究的目的及意义
• 第二章 转基因藻株的获得及其鉴定
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 藻种和菌株
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 主要试剂的配制方法
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 载体构建中常用方法
•     2.2.2 莱茵衣藻表达载体的构建
•     2.2.3 CC-503 藻株Ble抗性浓度的筛选
•     2.2.4 玻璃珠法遗传转化衣藻CC-
•     2.2.5 转化藻株的筛选培养
•     2.2.6 不同藻系藻细胞的培养收集
•     2.2.7 转化藻株的分子生物学验证
•     2.2.8 数据分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 目的基因的获取
•     2.3.2 克隆载体的获取及验证
•     2.3.3 表达载体的获取及验证
•     2.3.4 CC-503 藻株Ble抗性筛选浓度的确定
•     2.3.5 玻璃珠法介导的莱茵衣藻CC-503 遗传转化以及阳性藻株的筛选
•     2.3.6 转化藻株的验证
•     2.3.7 转基因藻株的MT的含量变化及生长情况
•   2.4 讨论
• 第三章 转基因莱茵衣藻在盐胁迫下的功能研究
•   3.1 实验材料与试剂盒
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 莱茵衣藻细胞的培养
•     3.1.3 主要的试剂盒
•     3.1.4 试剂及其配制
•     3.1.5 主要仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 莱茵衣藻CC-503 NaCl抗性浓度的筛选
•     3.2.2 不同藻系藻细胞的盐处理
•     3.2.3 衣藻细胞形态观察
•     3.2.4 藻细胞内MT含量的测定
•     3.2.5 衣藻细胞内抗氧化酶活性的测定
•     3.2.6 衣藻细胞内ROS和 MDA含量的测定
•     3.2.7 RNA的提取和基因的表达分析
•   3.3 数据处理与分析
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 野生型莱茵衣藻CC-503 NaCl抗性浓度的筛选
•     3.4.2 NaCl胁迫对不同藻系细胞形态的影响
•     3.4.3 NaCl胁迫条件对不同藻系中MT含量的影响
•     3.4.4 NaCl胁迫条件对不同藻系抗氧化物酶活性的影响
•     3.4.5 NaCl胁迫条件对不同藻系细胞内ROS变化的影响
•     3.4.6 NaCl胁迫对不同藻系中抗氧化物酶相关基因表达情况的影响
•   3.5 讨论
• 第四章 MT在盐胁迫下对莜麦幼苗生长和抗氧化能力的影响
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 植物材料与培养条件
•     4.1.2 试剂与试剂盒
•     4.1.3 莜麦最适Na Cl浓度和MT浓度的筛选
•     4.1.4 实验设计与测定项目
•     4.1.5 数据统计与分析
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 莜麦最适Na Cl浓度和MT浓度的筛选
•     4.2.2 外源MT在盐胁迫条件下对莜麦幼苗生长的影响
•     4.2.3 外源MT在盐胁迫条件下对莜麦幼苗抗氧化酶活性的影响
•     4.2.4 外源MT在盐胁迫条件下对莜麦幼苗细胞内渗透物质含量的影响
•     4.2.5 外源MT在盐胁迫条件下对莜麦幼苗细胞内ROS的影响
•     4.2.6 外源MT在盐胁迫条件下对莜麦幼苗细胞内脂质过氧化酶基因的影响
•     4.2.7 外源MT在盐胁迫条件下对莜麦幼苗MAPKs基因表达情况的影响
•     4.2.8 外源MT在盐胁迫条件下对莜麦幼苗TFs表达情况的影响
•   4.3 讨论
• 论文主要结论、创新点与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高文英

导师: 王英娟

关键词: 褪黑素,芳基烷基胺乙酰基转移酶,莱茵衣藻,莜麦,抗氧化能力

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北大学

分类号: Q945

总页数: 90

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