乳源酵母Kluyveromyces marxianus 246菌株及其抗葡萄糖阻遏研究

论文摘要

葡萄糖阻遏（Glucose repression）是微生物界普遍存在的现象,酵母菌在漫长的进化过程中获得了优先利用高效碳源的机制,使它们拥有了适应环境条件变化的竞争优势。而从发酵工业的角度而言,这种葡萄糖的存在抑制酵母细胞利用其它碳源的机制,往往是影响原料利用率,降低生产效率的主要障碍之一。本研究从采自内蒙古地区的3份酸马奶（Koumiss）样品中筛选获得一株天然抗葡萄糖阻遏酵Kluyveromyces marxianus 246,通过RNA-Seq技术研究葡萄糖对KM246与对照菌株DSMZ5422基因表达影响及显著富集的代谢通路,解析其抗葡萄糖阻遏的分子机制。再通过乳糖酶活性及基因表达的差异,进一步验证KM246菌株的抗葡萄糖阻遏效应。优化确定了KM246菌株直投式发酵剂制备的工艺条件。获得研究结果如下:（1）抗葡萄糖阻遏酵母菌株的筛选及鉴定从内蒙古采集的3份传统酸马奶中筛选出一株具有抗葡萄糖阻遏作用的酵母菌,根据细胞和菌落形态、生理生化生物学特征,结合分子生物学方法鉴定其为马克斯克鲁维酵母（K.marxianus）,将其命名为KM246。（2）抗葡萄糖阻遏菌株KM246的转录组分析通过将KM246和K.marxianus标准菌株DSMZ5422分别在单独碳源培养基（葡萄糖或乳糖）和混合糖培养基（葡萄糖和乳糖）上培养,根据残糖量曲线,对不同碳源和不同生长阶段的细胞进行转录组测序,分析了相关基因的表达水平及其调控机制。推测由于KM246菌株中Mig1基因表达量的降低,使受其调控的乳糖通透酶、乳糖酶以及半乳糖代谢网络中结构基因的转录得到解阻遏,所以乳源酵母KM246的相关基因获得适应性进化从而具有抗葡萄糖阻遏作用。（3）抗葡萄糖阻遏菌株KM246乳糖酶活性及基因表达研究本研究以DSMZ5422菌株为对照,分析KM246和DSMZ5422菌株乳糖酶活力和基因表达量变化趋势的差异性。结果表明,KM246与DSMZ5422在混合碳源培养基中的碳源利用情况、乳糖酶活力情况以及乳糖酶基因的表达量趋势基本相符,也从乳糖酶活力和表达量方面验证了KM246的抗葡萄糖阻遏作用。（4）KM246菌株直投式发酵剂的制备本研究以发酵剂冻干后的活菌数为指标,通过单因素实验和正交实验对KM246的冻干工艺进行优化。结果表明,增殖培养基条件为葡萄糖7%、硝酸钾3%、酵母粉2%、初始pH为8.0、接种量为2%,在30℃,225 r/min条件下培养20h后终止发酵,得到3.04×108 CFU/mL的高密度发酵液。保护剂最佳组合为脱脂乳粉10%、蔗糖7.5%、谷氨酸钠2.5%、甘露醇5%,6000 rpm离心15min后与保护剂按照5:1比例充分混合,-80℃预冻1 h后进行冷冻干燥,冻干时间为40 h时其含水率降至6.9%,在此条件下得到活菌数为4.4×108CFU/g的干粉制剂,满足生产要求。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）及分类地位
•   1.2 酵母菌的葡萄糖阻遏作用及其研究现状
•     1.2.1 Snf1-Mig1 途径
•     1.2.2 Rgt2/Snf3 途径
•     1.2.3 cAMP-PKA途径
•     1.2.4 酿酒酵母中的葡萄糖信号传导网络
•     1.2.5 酿酒酵母半乳糖代谢网络
•     1.2.6 酵母抗葡萄糖阻遏基因工程菌的构建
•   1.3 转录组学研究进展
•     1.3.1 转录组学基本定义
•     1.3.2 研究转录组的基本方法
•     1.3.3 转录组学主要用途
•   1.4 乳糖酶研究现状
•     1.4.1 乳糖酶的酶源
•     1.4.2 微生物乳糖酶的特性
•     1.4.3 微生物乳糖酶的应用
•   1.5 酵母菌干燥技术的概述
•     1.5.1 酵母菌的干燥技术
•     1.5.2 酵母菌的真空冷冻干燥技术
•     1.5.3 由冷冻干燥造成损伤的种类[106]
•   1.6 研究意义及研究内容
•     1.6.1 研究意义
•     1.6.2 研究内容
• 第二章 抗葡萄糖阻遏酵母菌株的筛选及鉴定
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 样品来源
•     2.2.2 主要试剂
•     2.2.3 试剂配制
•     2.2.4 仪器设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 酵母菌的分离
•     2.3.2 同化乳糖酵母的筛选
•     2.3.3 抗葡萄糖阻遏作用酵母的筛选
•     2.3.4 酵母菌的生理生化特征及鉴定
•     2.3.5 系统发育分析
•     2.3.6 生长曲线的绘制
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 酵母菌的分离
•     2.4.2 同化乳糖酵母的筛选
•     2.4.3 抗葡萄糖阻遏作用酵母的筛选
•     2.4.4 酵母菌的生理生化特征及鉴定
•     2.4.5 系统发育分析
•     2.4.6 生长曲线的绘制
•   2.5 讨论
• 第三章 抗葡萄糖阻遏菌株KM246 的转录组分析
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验菌种
•     3.2.2 试剂配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 不同培养基中KM246和DSMZ5422 的碳源利用情况
•     3.3.2 转录组取样及样品处理
•     3.3.3 总RNA提取、文库构建以及转录组测序
•     3.3.4 信息分析流程
•     3.3.5 数据过滤统计及组装评估
•     3.3.6 基因功能注释
•     3.3.7 基因表达和差异性分析
•     3.3.8 功能分析
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 不同培养基中KM246和DSMZ5422 的碳源利用情况
•     3.4.2 样本信息
•     3.4.3 转录组测序数据质量分析
•     3.4.4 基因功能预测及注释
•     3.4.5 实时荧光定量RT-qPCR验证转录组测序准确性
•     3.4.6 基因的差异表达分析
•     3.4.7 差异表达基因的代谢途径分析
•     3.4.8 半乳糖代谢通路中差异基因的分析
•   3.5 讨论
• 第四章 KM246 乳糖酶活性及基因表达研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验菌种
•     4.2.2 主要试剂
•     4.2.3 试剂配制
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 样品准备
•     4.3.2 抗葡萄糖阻遏酵母KM246 乳糖酶活性研究
•     4.3.3 抗葡萄糖阻遏酵母KM246 乳糖酶表达量研究
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 KM246和DSMZ5422 利用碳源情况
•     4.4.2 抗葡萄糖阻遏酵母KM246 乳糖酶活性研究
•     4.4.3 抗葡萄糖阻遏酵母KM246 乳糖酶表达量研究
•   4.5 讨论
• 第五章 KM246 菌株直投式发酵剂的制备
•   5.1 引言
•   5.2 实验材料
•     5.2.1 实验菌种
•     5.2.2 仪器设备
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 KM246 增殖优化的研究
•     5.3.2 KM246 冻干工艺的优化
•   5.4 实验结果
•     5.4.1 马克斯克鲁维酵母增殖优化的研究
•     5.4.2 真空冷冻干燥法制备马克斯克鲁维酵母菌活性干粉的研究
•   5.5 讨论
• 总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录 攻读硕士期间发表论文及申请专利目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 沈璐

导师: 伊日布斯

关键词: 马克斯克鲁维酵母,抗葡萄糖阻遏作用,转录组测序,乳糖酶,发酵剂

来源: 昆明理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 昆明理工大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27200/d.cnki.gkmlu.2019.001844

总页数: 132

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